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SOD方法

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SOD测量方法(NBT法)

一:试剂

1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液(pH7.8);

2. 130mmol/L 甲硫氨酸(Met)溶液:称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml;

3.750μmol/L 氮蓝四唑溶液:称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml,避光保存;

4. 100μmol/L EDTA-Na2溶液:称取0.03721gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml;

5. 100μmol/L 核黄素溶液:称取0.038g核黄素用蒸馏水定容至100ml(用时再稀释十倍)避光保存(配100的吧)。

(0.08ml酶液+水0.22+PBS1.5+其他都是0.3(4个)=3ml)(用缓冲液定容) 二:步骤

1. 酶液提取 取一定部位的植物叶片(视需要定,去叶脉)0.5g于预冷的研钵中,1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆,加缓冲液使终体积为5ml。取1.5~2ml于1000rpm下离心20min(10000rpm20m),上清液即为SOD粗提液。

2. 显色反应 取5ml指形管(要求透明度好)4支,2支为测定管,另2支为对照管, 2支对照管以缓冲液代替酶液,总体积3.0混匀后将1支对照管置暗处,其它各管于4000Lx日光下反应20min(要求各管受光情况一致,温度高时间缩短,低时延长)。

3. SOD活性测定与计算 至反应结束后,以不照光的对照管做空白,分别测定其它各管的吸光度(560nm)。

三:计算公式

已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示,按下式计算SOD活性。

SOD总活性=(Ack-AE)×V/(Ack×0.5×W×Vt) 上式中,SOD比活力=SOD总活性蛋白质含量式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表示;比活力单位以酶单位/mg蛋白表示Ack照光对照管的吸光度AE样品管的吸光度V(5)样品液总体积(ml)V(t1.5-2)测定时样品用量(ml)W样鲜重(g)蛋白质含量单位为:mg蛋白/g鲜重。 (不见光的调零)

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