一种L-茶氨酸的合成方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 1063748 A (43)申请公布日 2017.06.27

(21)申请号 2015109732.X(22)申请日 2015.12.21

(71)申请人中国科学院天津工业生物技术研究

所

地址300308 天津市滨海新区空港经济区西

七道32号(72)发明人祝俊 李元 刘珊

(74)专利代理机构北京品源专利代理有限公司

11332

代理人巩克栋 侯潇潇(51)Int.Cl.

C12P 13/04(2006.01)

权利要求书1页 说明书6页

序列表2页

(54)发明名称

一种L-茶氨酸的合成方法(57)摘要

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种L-茶氨酸的合成方法，所述方法包括：以γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶为催化剂，以L-谷氨酸钠和乙胺盐酸盐为底物合成L-茶氨酸。本发明方法以价格相对低廉的L-谷氨酸钠和乙胺盐酸盐为起始原料，以可大量生产的克隆表达蛋白为催化剂，具有反应条件温和、专一性强、反应转化率高、操作简便、对反应设备要求低、环境污染小等优点。

C N 1 0 6 8 9 3 7 4 8 ACN 1063748 A

权　利　要　求　书

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1.一种L-茶氨酸的合成方法，其特征在于，所述方法包括：以γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶为催化剂，以L-谷氨酸钠和乙胺盐酸盐为底物合成L-茶氨酸。

2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶的基因克隆在同一表达载体上。

3.根据权利要求1或2所述的合成方法，其特征在于，所述γ-谷氨酰甲胺合成酶来源于Methylovorus mays；

优选地，所述磷酸激酶来源于Eschierichia coli、Rhodobacter sphaeroides或Chloroflexus aurantiacus中的任意一种。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的合成方法，其特征在于，所述克隆在同一表达载体上的γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶的核苷酸序列包含如SEQ ID NO.1所示的片段。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的合成方法，其特征在于，所述γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶加入的总酶量为1-25g/L，优选为2-20g/L，进一步优选为5-15g/L。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的L-茶氨酸的合成方法，其特征在于，所述L-谷氨酸钠的加入量为50-400mM；

优选地，所述乙胺盐酸盐的加入量为50-400mM；优选地，所述L-谷氨酸钠和乙胺盐酸盐的摩尔比为1:1-1:3，优选为1:1。7.根据权利要求1-6中任一项所述的L-茶氨酸的合成方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：在反应器中加入L-谷氨酸钠、乙胺盐酸盐、多聚磷酸盐、ATP、Mg2+和缓冲液，调节pH，加入γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶，调节温度进行反应。

8.根据权利要求7所述的合成方法，其特征在于，所述缓冲液为磷酸钾缓冲液、咪唑缓冲液或Tris-HCl缓冲液中的任意一种或至少两种的混合，优选为咪唑缓冲液；

优选地，所述缓冲液的浓度为20-150mM，优选为50-100mM，进一步优选为75mM；优选地，所述缓冲液的pH为7-9，优选为8。9.根据权利要求7或8所述的合成方法，其特征在于，所述多聚磷酸盐的加入量为5-200mM；

优选地，所述多聚磷酸盐为六偏磷酸钠；优选地，所述ATP的加入量为0.5-10mM，优选为0.8-6mM；优选地，所述Mg2+的加入量为10-300mM，优选为50-200mM。10.根据权利要求7-9中任一项所述的合成方法，其特征在于，所述调节pH为5.5-8.5，优选为7.0-7.5；

优选地，所述调节温度为20-50℃，优选为30-37℃；优选地，所述反应的时间为6-24h。

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一种L-茶氨酸的合成方法

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技术领域

[0001]本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种L-茶氨酸的合成方法，具体涉及一种利用微生物酶催化，以L-谷氨酸钠和乙胺盐酸盐为底物偶合酶法ATP再生系统合成L-茶氨酸的方法。

背景技术

[0002]L-茶氨酸(C7H14O3N2，又称γ-谷氨酰乙胺)是茶叶中所含的一种特殊氨基酸，具有多种用途：在普通食品中用于改善食品风味、强化营养等；在保健食品中用于镇静放松、改善睡眠、抗疲劳、提高学习记忆能力等；在医药领域已用于降低血压、预防癌症、预防阿尔茨海默症、控制抑郁症等。因此L-茶氨酸在饮料、功能食品、功能药物等方面有着广泛的需求。[0003]目前，L-茶氨酸的生产方法主要有提取法、化学法和生物法。提取法就是从茶叶组织中直接提取，由于茶氨酸在茶叶中含量很低，且原材料来源受限，导致生产成本过高，因而提取法并不适于大规模工业化生产。化学法合成L-茶氨酸均为谷氨酸衍生物与乙胺反应，涉及到谷氨酸的保护与脱保护，反应路线复杂，反应条件苛刻，副反应多，且容易产生消旋体，同时会有毒性物质残留，影响产品的品质。另外，会用到大量的有机溶剂，污染环境。[0004]酶法是近年来合成L-茶氨酸的新趋势，主要包括微生物发酵法和酶催化法。Li Jian的“LWT-Food Science and Technology”2008,41,883-8利用Xerocomus badius(mushroom)发酵制备L-茶氨酸。微生物发酵法专属性强、条件温和、环境污染少，但是其存在产物浓度和转化率低、发酵时间长、产物分离难度大、设备成本高等缺点。[0005]酶催化是一种高选择性反应，不同种类的酶可作用于不同构型和不同种类的特定底物，从而达到定向转化的目的。目前，专利和文献所报道的生产L-茶氨酸的酶主要有CN 102181501 A和CN 103409475 A公开了γ-谷氨酰转肽酶，CN 1688705 A和JP 2007185132 A公开了谷氨酰胺酶，“Biosci.Biotechnol.Biochem.2007,71(2),545-552”公开了谷氨酰胺合成酶，“Biosci.Biotechnol.Biochem.2008,72(5),1206-1211”和CN 104212757 A公开了γ-谷氨酰甲胺合成酶，都具有生产L-茶氨酸的功能。与传统的化学方法相比，酶催化制备方法效率高、专一性强、反应条件温和，是一种理想的制备L-茶氨酸的方法。然而目前利用γ-谷氨酰转肽酶和谷氨酰胺酶合成L-茶氨酸时，通常反应pH为9.0-11.0，反应条件为碱性；所用底物为谷氨酰胺，价格相对昂贵。此外，两种酶均可使底物谷氨酰胺水解，反应转化率不高，因此，反应中需要添加过量的另一种底物乙胺(2.0-10.0eq)来抑制谷氨酰胺水解。谷氨酰胺合成酶和γ-谷氨酰甲胺合成酶虽可在中性条件(pH 6.5-7.5)转化价格低廉的谷氨酸钠和等当量的乙胺合成L-茶氨酸，但其为耗能反应，需要消耗当量的ATP。Yamamoto的“Biosci.Biotechnol.Biochem.”2005,69,784-7；Biosci.Biotechnol.Biochem.2008,72(5),1206-1211中报道，利用谷氨酰胺合成酶或γ-谷氨酰甲胺合成酶偶合酵母发酵能量循环，实现ATP再生来合成L-茶氨酸。然而此种ATP再生方法利用的是酵母内的糖酵解途径，需要多个步骤，因此效率相对较低；同时反应体系中还需要考虑细胞膜通透性的问题。另外，反应中影响活细胞代谢的因素较多，使反应体系变得复杂，不利于工业化生产。

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因此，需要开发一种低成本且易于工业化放大的酶催化合成L-茶氨酸的新方法。

发明内容

[0007]针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种L-茶氨酸的合成方法，所述方法催化合成茶氨酸的同时实现反应中ATP再生。[0008]为达此目的，本发明采用以下技术方案：[0009]一方面，本发明提供一种L-茶氨酸的合成方法，所述方法包括：以γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶为催化剂，以L-谷氨酸钠和乙胺盐酸盐为底物合成L-茶氨酸。[0010]本发明中，所述L-茶氨酸的合成方法如下：

[0011]

利用磷酸激酶催化、以廉价易得的多聚磷酸盐为底物进行ATP再生，降低反应中ATP的添加量，实现ATP的循化利用。[0013]优选地，所述γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶的基因克隆在同一表达载体上。[0014]优选地，所述γ-谷氨酰甲胺合成酶来源于Methylovorus mays。[0015]优选地，所述磷酸激酶来源于Eschierichia coli、Rhodobacter sphaeroides或Chloroflexus aurantiacus中的任意一种。[0016]优选地，所述克隆在同一表达载体上的γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶的核苷酸序列包含如SEQ ID NO.1所示的片段。[0017]所述核苷酸序列如下：[0018]SEQ ID NO.1：

[0019]ATGATGGCCGAAGATCGTGCTATGCCGGTTATGCCGCCGGCTGCTGAC GCTGCTGAAGCCGTCCCGGCCGCTCCGACCGCCCTGCCGGAAGAAGGTCCGGCAGGTCCGGAAGCACCGCTGCAAACCCTGCATGGTCCGCGTCACTTTCCGGCAGTTGATGCGAACGCCATTCGCCAGGCTTTCGAAGGCGGTCATTATCCGTACCCGCGTCGCCTGGGCCGTGTGGTTTATGAAGCGGAAAAAGCCCGCCTGCAGGCAGAACTGCTGAAGGTCCAGATTTGGGCGCAAGAAACCGGTCAGAAATTTGTGATCCTGATGGAAGGCCGTGATGCGGCCGGTAAAGGCGGTACGATCAAGCGCTTCATGGAACATCTGAACCCGCGTTATGCACGCGTCGTGGCTCTGACCAAACCGGGCGAACGTGAACGCGGTCAATGGTTTTTCCAGCGTTACATTGAACACCTGCCGACGGCCGGCGAAATCGTGTTTTTCGATCGCAGCTGGTATAATCGTGCAGGCGTGGAACGCGTTATGGGTTTTTGCACCCCGTCTGAATACCTGGAATTTATGCGTCAAGCGCCGGAACTGGAACGTATGCTGGTTCGCTCAGGTATTCGTCTGTATAAATACTGGTTTTCGGTCACCCGCGATGAACAGCGTGCACGCTTCCTGGCCCGTGAAACGGACCCGCTGAAACGCTGGAAGCTGAGTCCGATTGATAAAGCGTCCCTGGACAAGTGGGATGACTATACCGAAGCAAAAGAAGCTATGTTTTTCTACACCGATACGGCAGACGCTCCGTGGACGATCGTGAAGTCCAACGATAAAAAGCGTGCCCGCCTGAATTGTATGCGTCACTTTCTGAGCTCTCTGGATTATCCGGGCAAAGACCCGGAAGTTGTCGGTGTCCCGGACCCGCTGATTGTGGGTCGTGCAGCTCAGGTTATCGGTACCGCTGCCGACATTCTGGACTCCGCCACCCCGCCGGCCCTGCGTAAACCGCGTCAAGGTTGAGTCGACAAGCTTAAGGAGATATAATGAAGAGCCTG

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[0012]

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GAAGAAGCACAAAAGTTTCTGGAAGACCACCATGTCAAGTATGTCCTGGCACAGTTCGTCGATATTCACGGCGTTGCTAAAGTGAAGAGCGTTCCGGCGTCTCATCTGAATGATATTCTGACCACGGGTGCAGGTTTTGCAGGCGGTGCTATTTGGGGTACCGGTATCGCACCGAACGGTCCGGATTATATGGCAATTGGTGAACTGAGTACGCTGTCCCTGATCCCGTGGCAGCCGGGTTATGCACGTCTGGTCTGCGACGGCCACGTGAATGGTAAACCGTATGAATTTGATACCCGTGTGGTTCTGAAACAGCAAATTGCACGTCTGGCAGAAAAGGGTTGGACCCTGTATACGGGTCTGGAACCGGAATTTTCACTGCTGAAAAAGGATGAACATGGCGCGGTGCACCCGTTCGATGACTCGGACACGCTGCAAAAACCGTGTTATGATTACAAGGGTATTACCCGCCATAGCCCGTTTCTGGAAAAACTGACGGAATCTCTGGTTGAAGTCGGCCTGGACATTTATCAGATCGATCACGAAGACGCCAATGGTCAATTTGAAATCAACTATACCTACGCCGATTGCCTGAAAAGTGCAGATGACTACATTATGTTCAAGATGGCGGCCTCCGAAATCGCGAACGAACTGGGTATTATCTGTAGTTTTATGCCGAAACCGTTCTCCAATCGTCCGGGCAACGGTATGCACATGCACATGTCAATTGGCGACGGTAAAAAGTCGCTGTTTCAGGATGACTCAGATCCGTCGGGCCTGGGTCTGAGTAAACTGGCTTATCATTTCCTGGGCGGTATCCTGGCACACGCACCGGCACTGGCAGCTGTTTGCGCACCGACCGTCAATTCTTACAAACGTCTGGTCGTGGGTCGCAGCCTGTCTGGTGCTACCTGGGCTCCGGCGTATATTGCGTACGGCAACAATAACCGTAGCACGCTGGTTCGCATCCCGTATGGCCGTCTGGAACTGCGCCTGCCGGATGGTTCTTGTAACCCGTACCTGGCAACCGCAGCAGTGATTGCAGCTGGTCTGGACGGTGTTGCACGTGAACTGGATCCGGGCACGGGTCGCGATGACAATCTGTATGATTACAGCCTGGAACAGCTGGCCGAATTTGGCATTGGTATCCTGCCGCAAAACCTGGGTGAAGCACTGGATGCTCTGGAAGCGGACCAGGTCATCATGGATGCGATGGGCCCGGGTCTGTCCAAAGAATTTGTTGAACTGAAGCGCATGGAATGGGTGGACTATATGCGTCATGTGTCGGACTGGGAAATCAACCGCTATGTTCAATTCTAC TGA。[0020]优选地，例如可所述γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶加入的总酶量为1-25g/L，以是1g/L、2g/L、3g/L、5g/L、6g/L、8g/L、10g/L、12g/L、13g/L、15g/L、16g/L、18g/L、20g/L、21g/L、22g/L、23g/L或25g/L，优选为2-20g/L，进一步优选为5-15g/L。[0021]优选地，所述L-谷氨酸钠的加入量为50-400mM，例如可以是50mM、51mM、52mM、53mM、55mM、56mM、58mM、60mM、62mM、63mM、65mM、68mM、70mM、80mM、90mM、100mM、120mM、150mM、160mM、180mM、200mM、220mM、250mM、260mM、280mM、300mM、320mM、350mM、360mM、380mM或400mM。

[0022]优选地，所述乙胺盐酸盐的加入量为50-400mM，例如可以是50mM、51mM、52mM、53mM、55mM、56mM、58mM、60mM、62mM、63mM、65mM、68mM、70mM、80mM、90mM、100mM、120mM、150mM、160mM、180mM、200mM、220mM、250mM、260mM、280mM、300mM、320mM、350mM、360mM、380mM或400mM。

[0023]优选地，所述L-谷氨酸钠和乙胺盐酸盐的摩尔比为1:1-1:3，优选为1:1。[0024]优选地，所述方法包括如下步骤：在反应器中加入L-谷氨酸钠、乙胺盐酸盐、多聚磷酸盐、ATP、Mg2+和缓冲液，调节pH，加入γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶，调节温度进行反应。

[0025]优选地，所述缓冲液为磷酸钾缓冲液、咪唑缓冲液或Tris-HCl缓冲液中的任意一种或至少两种的混合，优选为咪唑缓冲液。[0026]优选地，所述缓冲液的浓度为20-150mM，例如可以是20mM、21mM、22mM、25mM、26mM、30mM、32mM、35mM、36mM、38mM、40mM、 50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、13.mM、140mM或150mM，优选为50-100mM，进一步优选为75mM。[0027]优选地，所述缓冲液的pH为7-9，例如可以是7、7.2、7.5、7.8、8、8.2、8.5或9，优选

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为8。

优选地，所述多聚磷酸盐的加入量为5-200mM，例如可以是5mM、6mM、8mM、10mM、

20mM、25mM、26mM、30mM、32mM、35mM、36mM、38mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、13.mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM或200mM。[0029]优选地，所述多聚磷酸盐为六偏磷酸钠。[0030]优选地，所述ATP的加入量为0.5-10mM，例如可以是0.5mM、0.6mM、0.8mM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM或10mM，优选为0.8-6mM。[0031]优选地，所述Mg2+的加入量为10-300mM，例如可以是10mM、20mM、25mM、26mM、30mM、32mM、35mM、36mM、38mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、13.mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM、200mM、210mM、230mM、250mM、260mM、280mM或300mM，优选为50-200mM。[0032]优选地，所述调节pH为5.5-8.5，例如可以是5.5、6、6.5、7、7.5、8或8.5，优选为7.0-7.5。

[0033]优选地，所述调节温度为20-50℃，例如可以是20℃、21℃、23℃、25℃、26℃、28℃、30℃、32℃、35℃、36℃、38℃、40℃、41℃、42℃、43℃、45℃、46℃、48℃或50℃，优选为30-37℃。

[0034]优选地，所述反应的时间为6-24h，例如可以是6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、18h、20h、21h、22h、23h或24h。[0035]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

[0036](1)本发明方法利用微生物酶催化并偶合酶法ATP再生系统，在温和条件下合成L-茶氨酸，利用磷酸激酶催化、以廉价易得的多聚磷酸盐为底物进行ATP再生，降低反应中ATP的添加量，实现ATP的循化利用；

[0037](2)本发明方法产生L-茶氨酸的转化率可高达80％以上，ee值达到99％以上，且总的酶量和ATP的添加量都明显降低；

[0038](3)本发明方法以价格相对低廉的L-谷氨酸钠和乙胺盐酸盐为起始原料，以可大量生产的克隆表达蛋白为催化剂，具有反应条件温和、专一性强、反应转化率高、操作简便、对反应设备要求低、环境污染小等优点；

[0039](4)本发明方法与酵母发酵能量循环体系相比，酶法ATP再生只需一步反应且无透膜问题，反应体系简单、易控，有利于工业化放大，这些特点使整个L-茶氨酸的生产方法成本较低，有利于大批量的工业制备。具体实施方式

[0040]为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。[0041]实施例1酶法催化合成L-茶氨酸

[0042]在50mL反应瓶中依次加入终浓度为100mM谷氨酸钠、100mM乙胺盐酸盐、150mM六水合氯化镁、75mM六偏磷酸钠、5mM三磷酸腺苷二钠(ATP)和75mM咪唑缓冲液(pH 8.0)，加水溶解使终体积为10mL，用5M氢氧化钠溶液调节反应pH为7.0，加入50mgγ-谷氨酰甲胺合成酶和40mg磷酸激酶。在37℃、200rpm下反应24h后，取样进行HPLC分析。

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[0028]

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检测方法为：TAG；UV 210nm检测；流动相：醋酸铵缓冲

液(5mM，pH 6.0)/甲醇＝25/75，v:v。

[0044]结果显示，L-茶氨酸的转化率为93％，ee值>99％。[0045]实施例2酶法催化合成L-茶氨酸

[0046]在100mL反应瓶中依次加入终浓度为200mM谷氨酸钠、200mM乙胺盐酸盐、150mM六水合氯化镁、75mM六偏磷酸钠、5mM三磷酸腺苷二钠(ATP)，加水溶解使终体积为50mL，用5M氢氧化钠溶液调节反应pH为7.0，加入250mgγ-谷氨酰甲胺合成酶和200mg磷酸激酶。在37℃、机械搅拌下反应，反应过程中用2M氢氧化钠溶液维持反应pH为7.0。反应7h后，取样进行HPLC分析检测方法同实施例1。[0047]结果显示，转化率为90％，ee值>99％。[0048]实施例3酶法催化合成L-茶氨酸

[0049]在100mL反应瓶中依次加入终浓度为400mM谷氨酸钠、400mM乙胺盐酸盐、300mM六水合氯化镁、150mM六偏磷酸钠、5mM三磷酸腺苷二钠(ATP)，加水溶解使终体积为50mL，用5M氢氧化钠溶液调节反应pH为7.0，加入250mgγ-谷氨酰甲胺合成酶和200mg磷酸激酶。在37℃、机械搅拌下下反应，反应过程中用2M氢氧化钠溶液维持反应pH为7.0，反应1h后补加250mgγ-谷氨酰甲胺合成酶和200mg磷酸激酶。反应24h后，取样进行HPLC分析，检测方法同实施例1。

[0050]结果显示，转化率为80％，ee值>99％。

[0051]实施例4基因工程菌种的构建及酶的表达纯化[0052](1)pET21a(+)-ppk的构建

[0053]用质粒抽提试剂盒抽提质粒pET-21a(+)，用NdeI/SalI双酶在37℃下酶切质 粒2h，酶切体系为：质粒50μL，10×buffer 10μL，NdeI 3μL，SalI 3μL，水34μL，电泳回收5.4kb的pET-21a(+)片段。

[0054]用NdeI/SalI双酶在37℃下酶切合成的含有磷酸激酶(US20050287627 A1，SEQ ID NO 125)编码基因ppk的质粒2h，酶切体系同上，电泳回收1kb的ppk片段。

[0055]将上述回收得到的5.4kb的pET-21a(+)片段与1kb的ppk片段在T4连接酶的作用下于22℃连接5h。连接产物用氯化钙法转化入感受态E.coli Top10，挑选转化子进行菌落PCR及双酶切鉴定，选择2-3个阳性转化子送测序进一步验证，测序结果显示构建成功。[0056](2)pET21a(+)-ppk+gmas的构建

[0057]将上述构建成功的pET21a(+)-ppk载体用HindIII在37℃水浴中酶切，酶切体系为：质粒50μL，10×buffer 10μL，HindIII 4μL，水36μL，1.5h后加入2μL碱性磷酸酶继续孵育0.5h，回收酶切产物。

[0058]使用下列引物从合成的含有γ-谷氨酰甲胺合成酶编码基因gmas(来源于Methylovorus mays NO.9，DDBJ登录号AB333782)的质粒PCR扩增gmas片段，PCR反应体系为：5×PCR buffer 10μL，dNTP 4μL，引物gmas-F和gmas-R(10μM)各2μL，模板0.5μL，

HS DNA Polymerase 0.5μL，加水补足至50μL条件为：94℃5min；94℃45s，58

℃30s，72℃90s，30个循环；72℃10min。电泳鉴定后直接纯化回收GMAS片段。[0059]gmas-F：CCCAAGCTTAAGGAGATATAATGAAGAGCCTGGAAGAAGCAC

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gmas-R：CCCAAGCTTTCAGTAGAATTGAACATAGCGGTTG

[0061]将扩增获得的gmas片段用HindIII单酶切，电泳回收后与上述HindIII单酶 切并去磷酸化的pET21a(+)-ppk载体在T4连接酶的作用下于22℃连接5h，连接产物用氯化钙法转化入感受态E.coli Top10，挑选转化子进行菌落PCR及双酶切鉴定，选择2-3个阳性转化子送测序进一步验证。测序结果显示构建成功。[0062](3)基因工程菌株的构建

[0063]将构建的重组质粒pET21a(+)-ppk+gmas用氯化钙法转化入宿主菌BL21(DE3)，LB试管培养过夜，质粒抽提试剂盒抽提质粒，将正确的克隆子BL21(DE3)/pET21a(+)-ppk+gams保存。

[00](4)重组蛋白的表达

[0065]挑取重组菌BL21(DE3)/pET21a(+)-ppk+gams接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡过夜培养。将培养物以1％的接种量转接于新鲜的含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.6-0.8，20℃IPTG诱导(终浓度0.1mM)过夜，离心收集细胞，20mM磷酸钠缓冲液(PH 8.0)重悬细胞，超声破碎，离心后将上清冷冻干燥得到的冻干粉粗酶制剂。

[0066]实施例5酶法催化合成L-茶氨酸

[0067]在50mL反应瓶中依次加入终浓度为100mM谷氨酸钠、100mM乙胺盐酸盐、150mM六水合氯化镁、75mM六偏磷酸钠、5mM三磷酸腺苷二钠(ATP)和75mM咪唑缓冲液(pH 8.0)，加水溶解使终体积为10mL，用5M氢氧化钠溶液调节反应pH为7.0，加入50mg实施例4中制备得到的粗酶制剂，在37℃、200rpm下反应24h后，取样进行HPLC分析，检测条件同实施例1。[0068]结果显示，ee值>99％。转化率为88％，[0069]实施例6酶法催化合成L-茶氨酸

[0070]在100mL反应瓶中依次加入终浓度为200mM谷氨酸钠、200mM乙胺盐酸盐、150mM六水合氯化镁、75mM六偏磷酸钠、5mM三磷酸腺苷二钠(ATP)， 加水溶解使终体积为50mL，用5M氢氧化钠溶液调节反应pH为7.0，加入250mg实施例4中制备得到的粗酶制剂，在37℃、机械搅拌下反应，反应过程中用2M氢氧化钠溶液维持反应pH为7.0。反应24h后，取样进行HPLC分析，检测方法同实施例1。[0071]结果显示，转化率为87％，ee值>99％。[0072]综上所述，本发明的方法能够生产L-茶氨酸，转化率达到80％以上，ee值达到99％以上，满足L-茶氨酸生产需要，不仅能降低ATP的用量，而且还能降低酶的总添加量，节约成本，为今后充分利用低成本的谷氨酸钠工业化生产L-茶氨酸提供了方法。[0073]申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

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