(19)中华人民共和国国家知识产权局
*CN103276099A*
(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 103276099 A(43)申请公布日 2013.09.04
(12)发明专利申请
(21)申请号 201310244798.X(22)申请日 2013.06.19
(71)申请人深圳市安之酶生物技术有限公司
地址518000 广东省深圳市坪山新区坪山金
牛西路16号华瀚科技工业园2号厂房二楼210A室(72)发明人侯志波 潘晓华 袁晶 卢伟
张戈 赵勇 邹卫国 徐家科(74)专利代理机构深圳市合道英联专利事务所
(普通合伙) 44309
代理人朱思全(51)Int.Cl.
C12Q 1/68(2006.01)C12N 15/11(2006.01)C12R 1/01(2006.01)
权利要求书1页 说明书4页权利要求书1页 说明书4页序列表3页 附图3页序列表3页 附图3页
(54)发明名称
用于荧光定量PCR检测幽门螺杆菌的引物和试剂盒(57)摘要
本发明提供一种用于荧光定量PCR检测幽门螺杆菌的引物、试剂盒及方法，其中引物序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示。利用该引物及检测方法可以快速、简单、特异且灵敏地检测幽门螺杆菌的存在。
CN 103276099 ACN 103276099 A
权 利 要 求 书
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1.一种用于荧光定量PCR检测幽门螺杆菌的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为：
正向引物：gccaggggggctgtggttgaattg，反向引物：gctttttgctcaaagaatccaaga。
2.与权利要求1所述的引物配合使用的荧光探针，其特征在于，所述探针的核苷酸序列为gcctttttaatggcgtgttag，该探针的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记荧光淬灭基团TAMRA。
3.一种用于荧光定量PCR检测幽门螺杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的引物和权利要求2所述的荧光探针。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含反转录酶，10×TaqMan 缓冲液，dNTP，TaqMan DNA聚合酶。
5.一种利用权利要求1所述的引物检测幽门螺杆菌的方法，其特征在于，提取待测样品mRNA，并以此合成cDNA；以样品cDNA为模板，利用权利要求1所述的引物和权利要求2所述的探针进行荧光定量PCR反应，根据扩增曲线判定结果。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述荧光定量PCR的反应体系每50µl组成如下：
cDNA
10×TaqMan缓冲液dNTP（2.5mM）TaqMan（5U/µl）正向引物（10µM）反向引物（10µM）探针（5µM）无菌蒸馏水共计
5µl5µl4µl0.25µl2µl2µl1µl
30.75µl50µl
。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述荧光定量PCR的反应程序为：94°C 2分钟； 94°C 30秒，60°C 60秒，进行40个循环；72°C 10分钟，4°C 保温。
8.权利要求3或4所述的试剂盒在检测幽门螺杆菌感染中的应用。
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CN 103276099 A
说 明 书
用于荧光定量PCR检测幽门螺杆菌的引物和试剂盒
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技术领域
[0001]
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于荧光定量PCR检测幽门螺杆菌的引
物和试剂盒。
背景技术
[0002] 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，简称Hp）是1983年由澳大利亚学者巴里•马歇尔（Barry J. Marshall）和罗宾•沃伦（J. Robin Warren）首次从胃粘膜组织中分离得到的一种革兰氏阴性杆菌，在胃粘膜上皮细胞表面常呈典型的螺旋状或弧形。当人体抵抗力下降时，幽门螺杆菌可通过口腔侵入胃和十二指肠粘膜上皮细胞而引起消化道疾病，如十二指肠溃疡、胃溃疡、消化不良、胃非霍奇金氏淋巴瘤甚至胃癌。幽门螺杆菌在人群中的感染率极高，已经成为世界学者广泛关注的问题。
[0003] 对幽门螺杆菌感染进行准确诊断可以有利于控制它的传播与流行。目前检测幽门螺杆菌感染的方法分为侵入性和非侵入性两类。侵入性方法依赖胃镜活检，包括快速尿素酶试验（RUT）、胃粘膜直接涂片染色镜检、胃粘膜组织切片染色镜检、细菌培养等。这些方法具有足够的敏感性和特异性，但成本高，需要专业人员操作，还可能引起患者不适，不利于临床应用，更不适用于大批量检测。非侵入性方法可能依赖于血清学方法和尿素呼吸试验，包括粪便Hp抗原检测、血清和分泌物抗体检测、尿素13C/14C呼气试验等。非侵入性方法不需借助胃镜检查、患者依从性较好，因而具有临床实际意义。[0004] 荧光定量PCR，也称作实时PCR（Real Time PCR），是美国PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出来的一种核酸定量技术。与常规PCR相比，荧光定量PCR技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且具有灵敏度高、特异性强、自动化程度高、操作安全方便等特点，已广泛应用于细菌、病毒等病原体检测、肿瘤基因检测、免疫分析、基因表达、突变及其多态性研究等多个领域。荧光定量PCR要用定量PCR仪，目前常见的仪器有ABI公司的7900HT系列，罗氏公司的Lightcycle系列，Robbett公司的RG系列。根据荧光化学原理不同可分为DNA结合染料（SYGB）、TaqMan探针技术等。
[0005] 迄今为止还未见关于荧光定量PCR方法快速检测幽门螺杆菌的报道。发明内容
本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一种荧光定量PCR技术检测幽门螺
杆菌的方法，该方法可以快速、简单、特异且灵敏地检测幽门螺杆菌的存在。[0007] 为了实现上述目的，本发明根据Genebank中已知的幽门螺杆菌基因的cDNA序列（序列号NC_000915），利用基因Blast软件系统寻找到其在幽门螺杆菌中十分保守的DNA序列，并设计合成了本发明用于荧光定量PCR检测幽门螺杆菌的引物。
[0006] [0008]
所述用于荧光定量PCR检测幽门螺杆菌的引物的核苷酸序列为：
正向引物：gccaggggggctgtggttgaattg（SEQ ID No.1），反向引物：gctttttgctcaaagaatccaaga（SEQ ID No.2）。
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CN 103276099 A[0009]
说 明 书
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与所述引物配合使用的探针核苷酸序列为gcctttttaatggcgtgttag （SEQ ID
No.3），该探针的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记荧光淬灭基团TAMRA。
[0010] 本发明还提供含有上述引物和荧光探针的检测试剂盒。在一种实施方式中，所述试剂盒还包含：反转录酶，10×TaqMan 缓冲液，dNTP，TaqMan DNA聚合酶。[0011] 本发明进一步提供利用上述引物检测幽门螺杆菌的方法，包括提取待测样品mRNA，并以此合成cDNA；以样品cDNA为模板，利用本发明提供的引物和探针进行荧光定量PCR反应，根据扩增曲线判定结果。[0012] 在一种优选的实施方式中，本发明的荧光定量PCR扩增反应体系为：
在一种优选的实施方式中，本发明的荧光定量PCR反应程序为：94°C 2分钟；94°C 30秒，60°C 60秒，进行40个循环；72°C 10分钟，4°C保温。[0013] 与现有技术中幽门螺杆菌的检测方法相比，本发明的荧光定量PCR检测方法具有操作快速、简单，对环境友好，检测结果准确等优点。本发明在常规PCR基础上运用荧光能量传递（fluorescence resonance energy transfer，FRET）技术，加入荧光标记探针，巧妙地把核酸扩增、杂交、光谱分析和实时检测技术结合在一起，借助于荧光信号来检测PCR产物，可以在拿到病人样本后数个小时获得确诊结果，准确度和特异性可以达到99%以上。由于PCR每循环一次，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步增长的过程，由此建立实时扩增曲线，准确地确定Threshold cycle (CT) 值，从而根据CT值确定起始DNA的拷贝数，做到真正意义上的DNA定量。另外由于CT值是一个完全客观的参数，CT值越小，模板DNA的起始拷贝数越小。因此，利用CT值确定DNA拷贝数实时PCR方法比普通终点定量方法更加准确。附图说明
[0014]
图1：本发明采用的TaqMan探针原理图；图2：本发明利用荧光定量PCR检测幽门螺杆菌的基本原理图；图3：本发明利用荧光定量PCR检测样品中幽门螺杆菌获得的扩增曲线；图4：本发明利用荧光定量PCR检测样品中幽门螺杆菌获得的溶解曲线。
具体实施方式
[0015] 下面结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，本领域技术人员可以理解，
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说 明 书
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以下实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，均为按照本领域内常规技术活条件或按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为普通市售产品。[0016] 试剂和仪器：
QIAamp Viral RNA Mini Kit、quivalent Extraction Kit、QIAGEN OneStep RT-PCR kit，QIAGEN公司；RNase inhibitor 20U/μl，ABI公司；实时定量PCR扩增仪（型号7600），ABI公司。
[0017] 实施例1：引物和探针的设计与合成根据Genebank中已知的幽门螺杆菌基因的cDNA序列（atggcgacacgaactcaagccaggggggctgtggttgaattgttgtatgcgtttgagagcggtaatgaagaaattaaaaaaatcgcttctagcatgttagaagaaaaaaagattaaaaacaaccaactcgctttcgctttaagcctttttaatggcgtgttagaaaaaatcaatgaaattgacgccctcatcgagccgcatttaaaagactgggatttcaagcgattagggagcatggaaaaggcgattttacgcttaggagcgtatgaaattggcttcacgcccacgcaaaaccctatcatcatcaatgaatgcatagagcttggcaaactctacgctgagcctaacacccctaaatttttaaacgctatcttggattctttgagcaaaaagctcactcaaaaacccttgaattga，SEQ ID No.5），设计合成引物及探针，包括：cDNA合成引物：Random 6 mers：tcaattcaagggtttttgagtgagc（SEQ ID No.4）；PCR反应引物：正向引物：gccaggggggctgtggttgaattg（SEQ ID No.1）；反向引物：gctttttgctcaaagaatccaaga（SEQ ID No.2）；TaqMan探针：FAM-gcctttttaatggcgtgttag-TAMRA（SEQ ID No.3）引物和探针的设计合成委托大连宝生物公司（TAKARA）完成。[0018] 实施例2：mRNA的提取使用QIAamp Viral RNA Mini Kit或Equivalent Extraction Kit，按照说明书中的具体配方和试剂比例，从人唾液中提取mRNA，最终提取液60ul。在随后进行RT-PCR反应时，mRNA提取液一次最大使用量是11ul，剩余的mRNA于-80℃保存。[0019] 实施例3：cDNA的合成逆转录反应体系：
逆转录反应条件：
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说 明 书
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使用QIAGEN OneStep RT-PCR kit和RNase inhibitor 20U/μl，50°C反应2小时，之后70°C孵育15分钟终止反应，生成的cDNA随即用于RT-PCR反应，或者置于-20°C保存备用。
[0020] 另外说明的是，本实施例中同时使用了Random 6 mers和Oligo dT Primer，可有效地将全长mRNA反转录成cDNA。试剂都来自QIAGEN公司。使用单引物进行反转录时，使用量分别如下：Random 6 mers（100μM） 2.0μl（200 pmol）；Oligo dT Primer（50μM） 0.5 μl（25pmol）；Specific Primer（2μM） 0.5 μl（1pmol）。本实施例中反应体系为20μl，根据实际情况可按需求相应放大，10μl反应体系可最大使用1μg的Total RNA。[0021] 实施例4：荧光定量PCR反应参照Applied Biosystems（ABI）公司的试剂说明书进行操作。[0022] 荧光定量PCR扩增反应体系：
荧光定量PCR反应程序：94°C 2分钟； 94°C 30秒，60°C 60秒，进行40个循环；72°C 10分钟，4°C 保温。[0023] 实施例5：幽门螺杆菌的检测与定量
本发明采用TaqMan荧光定量PCR方法检测幽门螺杆菌的存在，在反应体系中加入TaqMan荧光探针，实时监测荧光信号积累的整个PCR进程，最后通过已知浓度的幽门螺杆菌标准品制作的标准曲线对未知浓度的样品进行定量分析。基本原理如图2所示。[0024] 本发明对4个未知样品进行PCR扩增，每个样品重复1次，得到的扩增曲线如图3所示。其中1号样品的循环圈数（Ct值）为20，2号样品的Ct值为21，3号样品的Ct值为23.5，4号样品的Ct值为31。比对标准曲线，可以定量地获得四个样品对应的幽门螺杆菌数目分别为1*104个，1*103个，5个，0个。[0025] 同时，本发明通过每个样品的溶解曲线来判断反应的特异性。如上4个样品的溶解曲线如图4所示。溶解曲线呈明显的尖锐单峰，表明扩增非常特异。
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序 列 表
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SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市安之酶生物技术有限公司
<120> 用于荧光定量PCR检测幽门螺杆菌的引物和试剂盒
<130> 案号是YL113-042<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1<211> 24<212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> 人工序列 <220>
<221> misc_feature<222> (1)..(24)<223> 正向引物
<400> 1
gccagggggg ctgtggttga attg 24
<210> 2<211> 24<212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> 人工序列
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序 列 表
2/3页
<220>
<221> misc_feature<222> (1)..(24)<223> 反向引物
<400> 2
gctttttgct caaagaatcc aaga 24
<210> 3<211> 21<212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> 人工序列 <220>
<221> misc_feature<222> (1)..(21)<223> 探针
<400> 3
gcctttttaa tggcgtgtta g 21
<210> 4<211> 25<212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> 人工序列 <220>
<221> misc_feature<222> (1)..(25)
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序 列 表
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<223> cDNA合成引物Random 6 mers
<400> 4
tcaattcaag ggtttttgag tgagc 25
<210> 5<211> 417<212> DNA
<213> Helicobacter pylori <220>
<221> misc_feature<222> (1)..(417)
<223> 幽门螺杆菌基因cDNA序列
<400> 5
atggcgacac gaactcaagc caggggggct gtggttgaat tgttgtatgc gtttgagagc 60
ggtaatgaag aaattaaaaa aatcgcttct agcatgttag aagaaaaaaa gattaaaaac 120
aaccaactcg ctttcgcttt aagccttttt aatggcgtgt tagaaaaaat caatgaaatt 180
gacgccctca tcgagccgca tttaaaagac tgggatttca agcgattagg gagcatggaa 240
aaggcgattt tacgcttagg agcgtatgaa attggcttca cgcccacgca aaaccctatc 300
atcatcaatg aatgcataga gcttggcaaa ctctacgctg agcctaacac ccctaaattt 360
ttaaacgcta tcttggattc tttgagcaaa aagctcactc aaaaaccctt gaattga 417
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说 明 书 附 图
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图2
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图4
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