牛源性无乳链球菌分离鉴定及 cfb 基因的克隆和真核表达载体的构建

体的构建

阚威;王华;马友记;赵兴绪;张勇

【摘 要】In order to develop genetic engineering subunit vaccine ,milk samples of cows with subclinic mastitis were collected .THB ( Todd-Hewitt Broth ) solid selective medium and pigment test were adopted , combined with species specific gene cfb to isolate and identify Streptococcus agalactiae.ORF and B cell epitope analysis were car-ried out according to the cfb gene sequences published in GenBank .Primers designed with Primer 5 in cfb′s B cell epitope enriched sequence and eukaryotic expression elements and restriction enzyme sites were added .Genome DNA of the isolates were extracted and served as PCR templates for cfb amplification,prior to link with the T-A clo-ning vector for

sequencing.Correctly cloned cfb sequence were then linked to the pcDNATM 3.1 V5-His A(pcDNA-cfb) and transformed to DH5αcompetent cell for plasmid proliferation and sequencing .Results showed 8 strains of Streptococcus agalactiaee were characterized from milk samples,and the pcDNA-cfb was successfully constructed . Primary selection by THB selective medium and pigment test could be used for quick isolation of Streptococcus aga-lactiae.Analysis of the cfb sequence by Bcepred and Lasergene-Protean software showed the cloned cfb sequence contained multiple dominant B cell epitope ,thus had the potential to serve as target gene sequence for genetic engi-neering subunit vaccine of Streptococcus

agalactiae.This work could served as the basis for further developing genet-ic engineering subunit vaccine for Streptococcus agalactiae.%为研制奶牛乳房炎无乳链球菌的基因工程疫苗，采集隐性奶牛乳房炎奶样，利用THB （ Todd-Hewitt Broth ）固体选择培养基和色素试验，并结合无乳链球菌种属特异性基因cfb，采用PCR技术从隐性乳房炎奶样中分离和鉴定无乳链球菌。根据GenBank已报道的链球菌cfb基因序列，经ORF分析和B细胞表位预测，利用Primer 5．0软件设计cfb因子富含B细胞表位区域引物，添加酶切位点和真核表达元件，以分离株无乳链球菌的基因组为模板，PCR扩增cfb基因并连接T载体克隆测序，经测序确定无误后，连接pcDNATM 3．1 V5-His A（ pcDNA-cfb）真核载体，转化DH5α感受态细胞，提取重组质粒进行酶切和测序鉴定。结果显示，从份隐性奶牛乳房炎奶样中分离得到8株无乳链球菌，成功构建了真核表达载体（ pcDNA-cfb）。 THB和色素试验初步筛选，可以作为快速分离无乳链球菌的一种方法，利用Bcepred和Lasergene-Protean软件对分离得到的无乳链球菌cfb基因序列分析，在所克隆的cfb基因序列内有多个优势抗原表位，因此，有望作为无乳链球菌基因工程疫苗研制的抗原靶标基因序列，为进一步研究其基因工程疫苗提供基础条件。 【期刊名称】《华北农学报》 【年(卷),期】2014(000)005 【总页数】6页(P39-44)

【关键词】奶牛隐性乳房炎;无乳链球菌;cfb基因;真核载体构建 【作 者】阚威;王华;马友记;赵兴绪;张勇

【作者单位】甘肃农业大学 动物医学院，甘肃 兰州 730070;甘肃农业大学 动物医学院，甘肃 兰州 730070;甘肃农业大学 动物科学技术学院，甘肃 兰州 730070;甘肃农业大学 动物医学院，甘肃 兰州 730070;甘肃农业大学 动物医学院，甘肃 兰州 730070 【正文语种】中 文 【中图分类】Q78

无乳链球菌(Group B Streptococci or GBS)是人和动物常见的条件性病原菌之一。早在1887年就有引起牛乳房炎的报道，而对人的感染仅在50年前才发现。现已确认，GBS可引起奶牛乳房炎，人类主要是败血症、脑膜炎和心内膜炎[1-4]。在其黏附并定殖于宿主细胞，免疫逃避和适应宿主环境方面与多种毒力因子相关[5-6]。CAMP因子(cfb基因编码)是GBS分泌的一种溶血性物质，当GBS与金黄色葡萄球菌呈十字交叉共培养与血平板时，其交界部分会产生箭头状或半月形的特异溶血现象，被广泛用于GBS的生化鉴定[7-8]。实际上，血液中红细胞被潜在的鞘磷脂水解酶(葡萄球菌和其他多种细菌分泌的一种蛋白)第一次激活时，无乳链球菌CAMP因子即可引起红细胞的溶解[9]。鞘磷脂是红细胞膜成分，鞘磷脂水解酶一旦溶解红细胞膜中至少45%的鞘磷脂就会导致红细胞膜受损[10]。

CAMP因子分别可以导致兔、鼠和人类的红细胞膜鞘磷脂19%，25%，27%溶解，因此，这些物种对CAMP因子不敏感。而对山羊、绵羊和奶牛红细胞膜的鞘磷脂溶解性分别达到了46%，51%和52%[10-11]。CAMP因子本身没有酶活性，但有试验表明，其单体可以结合并寡聚体化红细胞膜成分，尤其是糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白，在红细胞膜上形成一个孔，造成绵羊、奶牛等红细胞的溶血[7，12]，所以可选用羊血平板进行GBS的CAMP试验。研究证实，动物机体的免疫球蛋白

IgG和IgM的Fc片段能与CAMP因子基因相结合，从而可以激活lgG和IgM的Fab片段活性[13]，在机体抗感染免疫功能中发挥作用[5]。如果将纯化的CAMP因子静脉注射给家兔，可导致家兔迅速死亡，因而推测CAMP因子是一种主要的致病因子。国内外已有个别有关CAMP因子克隆和原核表达的研究[14-17]，但尚不全面。本试验借助GBS选择性培养基和特异生化反应，结合其特有的cfb基因快速分离得到了无乳链球菌，预测其抗原性，构建真核表达载体pcDNATM3.1 V5-His A-cfb，为无乳链球菌基因工程疫苗的研制提供基础材料。 1 材料和方法 1.1 材料

1.1.1 待检材料 份乳腺炎奶样，采自宁夏吴忠市的3个奶牛场。 1.1.2 菌株 无乳链球菌标准菌株(中国农业科学院兰州畜牧兽医研究所李宏胜研究员惠赠)大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京全式金公司)。

1.1.3 主要试剂和设备 试剂:THB固体培养基、色素试验培养基、pGEM-T easy载体、LB固体、液体培养基，各种工具酶购自 Promega公司，pcDNATM 3.1 V5-His A真核载体购自Invitrogen公司，DNA提取试剂盒、回收试剂盒购自北京全式金公司。

设备:显微镜、恒温培养箱(DHP-9160B)、梯度PCR扩增仪(Bio-RAD，Mexico)，凝胶成像系统(Bio-RAD，USA)，DYY-12型电脑三恒多用电泳仪与DYCP-31A型电泳槽(北京六一仪器厂)、超微量紫外光分光光度计(德国Implen)。 1.1.4 引物 无乳链球菌16S RNA鉴定引物:根据已报道的无乳链球菌(GenBank:JQ2586.1)16S RNA基因的保守序列，设计1对引物: 上游引物:5′-CTGGTCTAAGGAGTTGCGAACGGG-3′; 下游引物:5′-ATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGC-3′。

无乳链球菌CAMP因子基因克隆加鉴定引物:利用已报道的无乳链球菌cfb基因序

列以及酶切位点分析在其开放阅读框(ORF)两侧设计1对引物:上 游 引 物:5′-AACGCTCGAGTTTTCATTGCGTGCC AACCCT-3′，包含一个 XhoⅠ的酶切位点;下游引物:5′-ACTGAAGCTTCTGTTTGAAGTGCTGCTTGTAA TG-3′，包含一个HindⅢ酶切位点。 重组质粒检测或测序引物:

上游引物:T7 Promoter:5′-TAATACGACTCACT ATAGGG-3′;

下游引物:BGH Reverse:5′-TAGAAGGCACAGT AGAGG-3′。引物由上海生工生物工程有限公司合成，PCR扩增条件如下表1。

表1 基因扩增使用的引物Tab.1 Primers for gene amplification基因名称 引物序列 退火温度/℃ 片段长度/bp Gene namePrimer sequencesTmLength 16S rRNA F:5′-CTGGTCTAAGGAGTTGCGAACGGG-3′ 56.0 721 R:5′-ATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGC-3′cfb F:5′-AACGCTCGAGTTTTCATTGCGTGCCAACCCT-3′ 57.0 492 R:5′-ACTGAAGCTTCTGTTTGAAGTGCTGCTTGTAATG-3′ 1.2 方法

1.2.1 无乳链球菌的快速分离 将采集的奶样作为菌株分离样品，用移液器移取100 μL奶样均匀涂布于THB固体培养基上，37℃培养18～24 h，挑取灰白色、表面光滑、边缘整齐、直径0.5～0.75 mm的细小菌落，转入色素培养基中进行穿刺培养，37℃培养18～24 h后，随机挑取一株穿刺线为黄色的菌落，在THB固体培养基上纯化培养，进行革兰氏染色镜检。

提取已纯化菌株的DNA作为PCR扩增模板，以表1引物及条件，扩增其16S RNA基因和cfb基因，cfb经连接转化并准确测序，测序结果在线Blast检测，以鉴定无乳链球菌。

1.2.2 无乳链球菌cfb基因的克隆测序 参照表1无乳链球菌cfb基因引物和PCR

扩增条件，以分离株无乳链球菌DNA为模板，扩增其加酶切位点的cfb基因序列。PCR产物经l%琼脂糖凝胶电泳回收，连接pGEM-T载体，转化大肠杆菌DH5α，经蓝白斑筛选，XhoⅠ、HindⅢ双酶切鉴定以及测序鉴定。

1.2.3 分离株无乳链球菌cfb基因序列分析 将上一步鉴定为阳性克隆菌液送往上海生工生物工程有限公司测序，测序所得基因序列采用 Bcepred、Lasergene-Protean和Lasergene-MegAlign软件进行B细胞抗原表位预测分析和序列同源性分析。

1.2.4 无乳链球菌cfb基因真核表达载体质粒的构建 利用 XhoⅠ、HindⅢ双酶切 pGEM-T-cfb，回收492 bp片段，pcDNATM 3.1A同样酶切，T4DNA连接酶16℃，过夜连接，连接液转化DH5α感受态细胞，构建重组表达质粒

pcDNATM3.1 V5-His A-cfb，经蓝白斑筛选后，将阳性菌落接种于加有氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃振荡过夜培养，提取质粒进行XhoⅠ、HindⅢ双酶切鉴定以及PCR鉴定。 2 结果与分析

2.1 无乳链球菌分离结果

利用THB固体培养基从奶样中分离45株疑似链球菌，将疑似链球菌穿刺接种于色素试验培养基中，其中有 12株疑似链球菌(W3Y6、W1Y1、W1Y29、W1Y19、W1Y44、W1Y7、W1Y56、W1Y28、W2Y2、W2Y10、W1Y26、W1Y21)使色素培养基变为黄色，可初步判定为疑似无乳链球菌。疑似无乳链球菌在THB固体平板上培养菌落均为白色、圆形、湿润、光滑、微隆起、边缘整齐的形态。菌体为球形或卵圆形，直径 0.5～2.0 μm，而在 THB 液体培养基培养时菌体多呈双个或短链状排列，革兰氏染色呈阳性反应，血琼脂平板呈现β溶血(图1)。

图1 无乳链球菌的分离Fig.1 Isolation of Streptococcus agalactiaeeA.THB选择培养无乳链球菌;B.疑似无乳链球菌镜检结果;C.疑似无乳链球菌溶血;D.色素试验。

A .Streptococcus agalactiaee on THB selective medium;B.Suspected Streptococcus agalactiaee;C.β-hemolysis of suspected Streptococcus agalactiaee;D.Islam medium assay.

对奶样中分离的12株疑似无乳链球菌进行PCR鉴定，结果显示，经PCR扩增后，被检测的12株细菌都可以扩增出预期大小的16S rRNA基因序列(图2)，而12株中有8株可以扩增出预期大小的cfb的基因序列(图3)，条带单一，特异性好。回收cfb基因扩增产物，经连接转化后准确测序，序列在线Blast检测，检测结果显示，8株分离株(W3Y6、W1Y1、W1Y29、W1Y19、W1Y44、W1Y7、W1Y56、W1Y28)cfb基因同已报道无乳链球菌序列具有高度同源性(＞99.0%)，综合选择性培养的生理生化特性与分子鉴定结果，可判定所分离的菌株为无乳链球菌。 图2 分离株16S rRNA基因的PCR扩增Fig.2 Amplification of 16S rRNA gene for the isolated bacteriaM.2000 DNA Marker;1.标准菌

株;2.W3Y6;3.W1Y1;4.W1Y29;5.W1Y19;6.W1Y44;7.W1Y7;8.W1Y56;9.W1Y28;10.W2Y2;11.W2Y10;12.W1Y26;13.W1Y21。图3 同。M.2000 DNA Marker;1.Standard strain;2-13.Isolates strains.The same as Fig.3 . 2.2 无乳链球菌cfb基因克隆和测序结果

以任意分离株无乳链球菌的DNA为模板，PCR扩增其cfb基因片段，PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测分析，发现在接近500 bp处有1条特异性的DNA片段条带，与预期目的基因片段大小相近。回收其目的基因片段，转化DH5α感受态细胞，经蓝白斑选择后，挑取阳性克隆测序，测序结果显示，分离株无乳链球菌cfb基因与GenBank登录号JQ2562.1、JQ2578.1、JQ2563.1、JQ2567.1、JQ2585.1、GU217532.1、HQ148672.1、JQ2575.1、X72754.1、JQ25.1、JQ2568.1、EF694027.1、JQ2562.1的菌株同源性为99%。

2.3 分离株无乳链球菌cfb克隆基因序列分析结果

采用Bcepred和Lasergene-Protean软件通过亲水性方案(Hydrophilicity)、柔韧性方案(Flexibility)、抗原指数方案(Antigenic index)、表面可及性(Surface probability)4种参数对已克隆目的基因蛋白序列进行B细胞表位初步预测，确定cfb的优势抗原表位的氨基酸残基为2～10，88～98，99～108，109～118位(图4)。

图3 分离株cfb基因克隆Fig.3 Amplification of cfb gene for the isolated bacteria

图4 分离株无乳链球菌株的B细胞抗原表位初步预测Fig.4 B cell antigen epitope preliminary forecast of isolates strain streptococcus agalactiaee 采用Lasergene-MegAlign对cfb基因进行同源性和进化分析，分析结果如图5，6所示。分离株14号与已报道菌株(1～12号)同源性≥98.0%，与13号菌株为97.8%。进化树分析可以看出分离株与已报道组处于2个群，已报道组菌株位于1个群，而分离株菌株单独处于1个群。

图5 分离株与已报道菌株cfb基因同源性比较Fig.5 Isolated strain compared with reported strain cfb gene homology1～13.GenBank已报道菌株;14.分离株。1-13.GenBank reported strains;14.Isolated strain. 2.4 无乳链球菌cfb基因真核表达载体的构建结果

将所克隆的cfb基因组入pcDNATM3.1 V5-His A，构建真核表达质粒 pcDNATM3.1 V5-His A-cfb，提取质粒经XhoⅠ和HindⅢ双酶切后在500 bp略下和5 000 bp以上各有1条DNA条带，并进PCR检测同样在接近500 bp处有一条特异性条带(图7，8)。重组质粒测序显示，在pcDNATM3.1 V5-His A真核载体多克隆位点出现cfb目的基因序列，说明重组质粒构建成功。

图7 重组质粒PCR检测Fig.7 Recombinant plasmid PCR detectionM.2000 DNA Marker;1～5:阳性克隆。M.2000 DNA Marker;1 ～5.Positive clones. 图8 重组质粒酶切鉴定Fig.8 Enzymolysis identification of recombinant plasmidM.2000 bp DNA Marker;1～3.不同浓度重组质粒酶切鉴定。M.2000 bp DNA Marker.1 ～ 3.Enzymolysis identification of recombinant plasmid with different concentration. 3 讨论

对奶样中无乳链球菌可以利用THB固体选择性培养基及色素培养基达到快速分离的结果，其中在THB 固体培养基中加入0.1～0.2 μg/mL结晶紫可以抑制奶样中革兰氏阳性的葡萄球菌生长，奶样中革兰氏阴性杆菌可以加入多粘菌素B 15 μg/mL抑制其生长。无乳链球菌在THB固体选择培养基上呈灰白色、表面光滑、边缘整齐的细小菌落，而在血琼脂平板上呈β或α溶血，转入色素培养基穿刺培养使穿刺线为黄色[18]。通过THB固体选择培养基和色素试验项目鉴定12株分离菌，初步判定分离菌株为无乳链球菌。进一步通过16S rRNA基因和cfb基因对这些分离株进行分子鉴定，确定其中8株为无乳链球菌。

兰氏分群中作为B群的无乳链球菌是奶牛乳房炎的主要致病菌，本试验从宁夏吴忠患乳房炎奶样中分离得到无乳链球菌，并提取其基因组DNA，利用PCR技术，成功地克隆出无乳链球菌CAMP因子(cfb基因)的基因序列。测序结果显示，克隆的基因片段与预期克隆的无乳链球菌CAMP因子基因长度、大小一致，与已报道的无乳链球菌CAMP因子的基因序列(GenBank:JQ2586.1)相比，有5个碱基位点发生突变，第121位T突变为G，第163位G突变为A，第241位A突变为G，第319位C突变为T，第331位C突变为T，同源性为99%。

利用基因重组技术，本试验成功地将已克隆并经测序分析的CAMP因子基因导入表达型真核载体质粒pcDNATM3.1 V5-His A中，经软件分析，所得基因序列内

部无XhoⅠ和HindⅢ酶切位点，pcDNATM3.1A经上述2种酶切后，不会影响基因序列编码区的内部结构。

对于无乳链球菌所能表现的CAMP现象，很久以来一直被作为实验室检测或诊断无乳链球菌的一个重要试验[19-23]。因此，设计无乳链球菌CAMP因子基因的特异性引物，PCR扩增其特异性基因片段，可以作为无乳链球菌的鉴定或临床诊断的一个重要指标。现研究证实，CAMP因子是无乳链球菌的一种重要致病因子，因而本试验通过分子生物学方法并结合无乳链球菌部分生化特征，可快速鉴定并分离无乳链球菌，为进一步开展奶牛链球菌性乳房炎的流行病学调查及其病原菌分布的研究提供数据支持。有研究表明[21-23]，在动物机体全身感染中，CAMP因子的释放会导致宿主细胞免疫应答效应的降低，从而导致动物机体的感染加重。在试验研究中克隆并表达无乳链球菌的CAMP因子蛋白，对探明它在宿主体内的作用机理及其免疫原性研究有重要意义，为奶牛乳腺炎无乳链球菌基因工程疫苗的研究提供基本材料。 参考文献:

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