中国药理学通报Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ２０１２ Ｊｕｎ；２８（６）：８４７～５２ ・８４７・ 网络出版时间：２０１２－５—１１ １４：０４ 网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０８６．Ｒ．２０１２０５１１．１４０４．２０１２０６．８４７＿０２６．ｈｔｒｎｌ 腺苷Ａ１受体激活在钙调磷酸酶信号通路上 对异丙肾上腺素诱导的心肌细胞肥大的抑制作用 邢玲 ，杨育红 ，王洪新 ，鲁美丽 。 （１．辽宁医学院药理学教研室；２．辽宁省心血管药物重点实验室，辽宁锦州 １２１０００） Ｎ６一（２－ｐｈｅｎｙｌｌｓｏｐｒｏｐｙ１）ａｄｅｎｏｓｉｎｅ（Ｒ—ＰＩＡ）１ Ｉｘｍｏｌ・Ｌ 对其 作用，进一步探讨钙调神经磷酸酶特异性抑制剂环孢菌素Ａ （ＣＳＡ）１ ｂ￣ｍｏｌ・Ｌ～、ＰＫＡ抑制剂ｃＡＭＰ三乙胺盐（ＲＰ— ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１—１９７８．２０１２．０６．０２６ 文献标志码：Ａ文章编号：１００１—１９７８（２０１２）０６—０８４７—０６ 中国图书分类号：Ｒ一３３２；Ｒ３２２．１１；Ｒ３９２．１１；Ｒ５４２．２０２．２； Ｒ９７７．３ ｃＡＭＰＳ）１ ｍ０１．Ｌ～、百日咳毒素（Ｐ１ｘ）５ ｍｇ・Ｌ 存在时， 观察腺苷Ａ 受体激活在钙调磷酸酶（ＣａＮ）通 体外培养大鼠乳鼠心肌细胞，以Ｉｓｏ １０ ｍｏｌ 摘要：目的腺苷Ａ１受体的激活对心肌细胞肥大的影响。通过Ｌｏｗｒｙ法 测心肌细胞蛋白含量；ＲＴ—ＰＣＲ法检测心肌细胞心钠素 （ＡＮＰ）的ｍＲＮＡ表达；Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法测心肌细胞ＣａＮ的相 对表达水平；以Ｆｌｕｏ一３／ＡＭ为荧光探针，共聚焦显微镜下测 路上对异丙肾上腺素（Ｉｓｏ）诱导的心肌细胞肥大的抑制作用 及机制。方法・Ｌ 诱导心肌细胞肥大，观察腺苷Ａ．受体激动剂Ｒ（一）一 量心肌细胞［ｃａ“］；瞬变。结果收稿日期：２０１２—０２—０９，修回日期：２０１２—０３—２８ 基金项目：辽宁省教育厅团队项目（Ｎｏ ２００９３０６４），辽宁省科技厅科 技计划项目（Ｎｏ ２００９２２５０１０４０） 作者简介：邢玲（１９８５一），女，硕士生，研究方向：心血管药理学， １０ ｔｘｍｏｌ・Ｌ Ｉｓｏ可以诱 导心肌细胞肥大，腺苷Ａ１受体激动剂Ｒ—ＰＩＡ可以使其蛋白 含量降低、ＡＮＰ的ｍＲＮＡ表达减少、ＣａＮ相对表达降低、 ［Ｃａ“］；荧光强度减小，ＣＳＡ、ＲＰ—ｃＡＭＰＳ有类似抑制作用， ＰＴＸ预处理的情况下，Ｒ—ＰＩＡ对Ｉｓｏ诱导的心肌肥大的抑制 作用消失。结论腺苷Ａ 受体可以通过钙调磷酸酶通路抑 Ｅ—ｍａｉｌ：ｘｉｎｇｌｉｎｇ５００＠１６３．ｃｏｎ； 杨育红（１９６７一），女，教授，硕士生导师，研究方向：心血 管药理学，通讯作者，Ｅ．ｍａｉｌ：ｊｚｗａｎｇｐｅｉｘｕｎ＠１６３．ｃｏｎ 制Ｉｓｏ诱导的心肌肥大，其机制与降低细胞内［ｃａ２ ］．浓度 及ＣａＮ表达有关。 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｙｒａｚｉｎｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ Ｈ１６８ ｏｎ ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ＺＨＡＮＧ Ｘｕｅ－ｊｉａｏ ，ＮＩ Ｃｈｕｎ—ｙａｎ ，ＺＨＡＮＧ Ｆｅｎｇ ，ＬＵ Ｙｉｎ ，ＺＨＥＮＧ Ｓｈｉ—ｚｈｏｎｇ ， （１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆＣｈｉｏｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｎｉｆｎｇ ２１００２９，Ｃｈｉｎａ；２．Ｊｉａｎｇｓｕ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆＣｈｉｎｅｓｅ Ｍａｔｅｒｉａ Ｍｅｄｉｃａ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆＣｈｉｏｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００４６，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｉｍ Ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｅｔｒａｍｅｔｈ－ ｓｅｓ．ＦＣＭ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｆｏｕｎｄ ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｙｒａｚｉｎｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ Ｈ１６８ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｄｏｓｅ—ｅｆｆｅｃｔ ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｎ ＨＳＣ．Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅ ｔｅｔｒａｍｅｔｈ． ｙｌｐｙｒａｚｉｎｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ Ｈｌ６８ ｏｎ ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ （ＨＳＣ）ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ＭＴＳ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｅｔｒａｍ— ｅｔｈｙｌｐｙｒａｚｉｎｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ Ｈ１６８ ｏｎ ＨＳＣ—Ｔ６ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ． ｙｌｐｙｒａｚｉｎｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ Ｈ１６８ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ＨＳＣ—Ｔ６ ｐｒｏｌｉｆｅｒａ— ｔｉｏｎ ｂｙ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｐ２１／ｐ２７ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｆｕｒｔｈｅｒ ｕｓｅ ｏｆ Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ ｌｉｇｕｓｔｒａｚｉｎｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ Ｈｌ６８ ｐｒｏｍｏｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐ２１／ｐ２７ ｍＲＮＡ．Ｃｏｎｃｌｕ・ Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（ＦＣＭ）ａ— ｎａｌｙｓｉｓ ｗｉｔｈ ＰＩ ｄｕａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ａｎｄ Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐ２１／ｐ２７．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｙｒａｚｉｎｅ ｓｉｏｎ Ｈ１６８ ｃａｎ ｉｎｈｉｂｉｔ ＨＳＣ－Ｔ６ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｍａｉｎｌｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐ２１／ｐ２７． ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ Ｈ１６８ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＳＣ—Ｔ６ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ．Ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ ｄｒｕｇ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｅｆｉｃａｃｙ ｏｎ ｉｆｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＨＳＣ—Ｔ６ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｓｈｏｗｅｄ ａ ｄｏｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍａｎｎｅｒ．Ｃｙｃｌｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｋｅｙ ｗｏｒｄ：ｈｅｐａｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ；ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｙｒａｚｉｎｅ ｄｅｒｉｖ— ａｔｉｖｅ；ＨＳＣ－Ｔ６；ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ；ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎ；ｓｍ ｌｆｏｗ ｅｙｔｏｍｅｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ｄｒｕｇ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ａｃｃｕｍｕｌａ— ｔｅｄ ｉｎ Ｇｏ／Ｇ１ ｐｈａｓｅ，ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｄ ｉｎ Ｓ ａｎｄ Ｇ２／Ｍ ｐｈａ— ・８４８・ 中国药理学通报Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ２０１２ Ｊｕｎ；２８（６） 关键词：心肌肥大；腺苷；异丙肾上腺素；钙调磷酸酶； ［ｃａ ］；瞬变；心钠素 血清，０．８４的ＤＭＥＭ培养基，及０．０１的双抗液（含 １００ ｋＵ・Ｌ 青霉素，１００ ｍｇ・Ｌ 链霉素）的培养 基，吹打均匀后以１×１０ ・Ｌ 的密度接种于底面 积２５ ｍｍ 培养瓶，或０．５×１０ ・Ｌ 的密度接种于 研究表明心肌细胞可以产生腺苷，而且心脏存 在腺苷受体，主要包括４种亚型Ａ１和Ａ２Ａ、Ａ２Ｂ、 Ａ３受体，其中Ａ１受体作用更为突出¨Ｊ。腺苷可以 激动Ａ１受体通过ｃａ 依赖性信号途径、通过 ＭＡＰＫｓ通路抑制心肌细胞［ｃａ ］ｉ瞬变抑制心肌细 胞肥大 Ｊ。大量研究表明 Ｊ，胞内Ｃａ 浓度的变 ２４孔培养板送人通以体积分数为５％ＣＯ 及９５％ 空气的二氧化碳孵箱中培养。 １．４分组及给药方法 常规培养心肌细胞４８ ｈ 后，为了减少血清中成分对检测结果的影响，加药前 更换液体时将培养基换为含小牛血清为０．０００４（体 化是触发细胞增殖相关信号的始发因素，是致心肌 肥厚的最基本信号，细胞内Ｃａ“浓度的升高则是外 界刺激（或）内在功能缺陷所致心肌肥大的重要环 节。各种病理性刺激引起心肌肥大的分子机制可以 认为是由于肥大基因的过度表达 ，胞内升高的 ｃａ 可以与钙调蛋白结合，调节其下游因子如钙调 磷酸酶（ｅａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ，ＣａＮ）发挥作用，而后者则是唯 一受Ｃａ“与钙调素（ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ，ＣａＭ）活化的磷蛋 白磷酸酶，通过使活化Ｔ细胞核因子３（Ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃ． ｔｏｒ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ３，ＮＦＡＴ３）去磷酸化移位到细 胞核而造成心肌肥大 Ｊ。有研究表明 ，Ｉｓｏ诱导 的心肌肥大细胞内ｃａ 水平升高、ＣａＮ表达增高， 而腺苷Ａ１受体激动对Ｉｓｏ诱导的心肌肥大抑制作 用中，是否直接通过ＣａＮ信号通路发生且机制如何 在国内外文献中则未见报道。本实验通过观察腺苷 Ａ１受体激动剂Ｒ（一）一Ｎ６一（２－ｐｈｅｎｙｌｌｓｏｐｒｏｐｙ１）ａ— ｄｅｎｏｓｉｎｅ（Ｒ—ＰＩＡ）１ ｍ０１．Ｌ 对心肌细胞的作用， 并着重观察腺苷Ａ１受体激动剂Ｒ—ＰＩＡ对Ｉｓｏ诱导 的心肌肥大中［ｃａ ］ｉ浓度相对水平、ＣａＮ表达的 变化，从而研究腺苷Ａ１受体抑制Ｉｓｏ诱导心肌肥大 的信号转导机制。 １材料与方法 １．１实验动物 生后２～３天的ＳＤ大鼠，早６不 拘，由辽宁医学院实验动物中心提供，动物合格证 号：ＳＣＸＫ（辽）２００３０００７。 １．２ 药品与试剂 胰蛋白酶（Ｔｒｙｐｓｉｎ）、Ｒ．ＰＩＡ、 ＣＳＡ、ＲＰ—ｃＡＭＰＳ、ＰＴＸ、ＣＳＡ、Ｉｓｏ、十二烷基硫酸钠 （ＳＤＳ）、钙荧光探剂Ｆｕｒａ一３／ＡＭ购自Ｓｉｇｍａ；低糖 ＤＭＥＭ培养基购自Ｇｉｂｃｏ；ＲＩＰＡｂｕｆｆｅｒ（ＳＤＳ，Ｔｒｉｔｅｒｎ Ｘ．１００，ＰＭＳＦ）购自上海生工；ＰＣＲ检测试剂盒购自 大连宝信生物技术公司，其他试剂均为分析纯。 １．３大鼠乳鼠心肌细胞原代培养 在无菌的条件 下，取出生２～３ ｄ的ＳＤ大鼠乳鼠，开胸取出心脏， 用Ｄ．ｈａｎｋｓ液冲洗液冲洗３次后剪成约１ ｍｍ 大小 的碎块，加入０．８ ｇ・Ｌ 胰蛋白酶消化细胞，取离心 并过滤消化后的细胞，加人体积分数为０．１５的小牛 积分数）的ＤＭＥＭ培养基，更换后送入通以体积分 数为５％ＣＯ 及９５％空气的二氧化碳孵箱中３０ ｍｉｎ 后，无菌条件下加药。每组用５个培养瓶；如果是培 养板，每板分为４组，每组６孔。有①正常组、② ＣＳＡ １ ｐ￣ｍｏｌ・Ｌ 组、⑧Ｉｓｏ １０ ｉｘｍｏｌ・Ｌ 组、④Ｉｓｏ １０ ｍ０ｌ・Ｌ ＋Ｒ－ＰＩＡ １ ｐ，ｍｏｌ・Ｌ 组、⑤Ｉｓｏ １０ ｐ￣ｍｏｌ・Ｌ ＋ＣＳＡ １ Ｉ￣ｍｏｌ・Ｌ 组、⑥Ｉｓｏ １０ Ｉ￣ｍｏｌ・ Ｌ ＋Ｒｐ－ｃＡＭＰＳ １ Ｉ￣ｍｏｌ・Ｌ一、⑦Ｉｓｏ １０ ｐ￣ｍｏｌ・Ｌ ＋ＣＳＡ １ Ｉｘｍｏｌ・Ｌ ＋Ｒ．ＰＩＡ １ ｍｏｌ・ＬＩ１组、⑧Ｉｓｏ １０ ｍｏｌ・Ｌ一 ＋ＰＴＸ ５ ｍｇ・Ｌ－。＋Ｒ—ＰＩＡ １ Ｉｘｍｏｌ・ Ｌ 组 ；各组药物的浓度以文献报道为标准，给药 ４８ ｈ后进行各项指标的测定：先给阻断剂预处理， 接着送人通以体积分数为５％ＣＯ：及９５％空气的 二氧化碳孵箱中３０ ｍｉｎ后取出给保护药，继续送入 通以体积分数为５％ＣＯ，及９５％空气的二氧化碳 孵箱中３０ ｍｉｎ后取出加人造模药Ｉｓｏ ４８ ｈ后进行各 项指标的测定。 １．５培养心肌细胞蛋白质含量的测定 吸去培养 板各孔中的培养液，用Ｄ．Ｈａｎｋｓ液快速冲洗３次后， 加入１０ ｇ・Ｌ ＳＤＳ（十二烷基硫酸钠）０．５ ｍｌ溶解 细胞，根据计数，每孔细胞数约为５×１０ 个，Ｌｏｗ． ｒｙｓ ｌＯ Ｊ方法测每孔细胞蛋白质含量。 １．６ ＲＴ－ＰＣＲ法测心肌细胞ＡＮＰ的ｍＲＮＡ表 达 心肌细胞（１×１０ 个・Ｌ ）种植于培养瓶， 分组药物处理４８ ｈ后，弃去培养液，ＰＢＳ洗涤２次， 细胞刮刀刮细胞，收集入ＥＰ管，离心后弃去上清 液，加入ＴＲＩｚｏｌ试剂完全裂解细胞，收集细胞裂解 液，取１ ｍｌ裂解液，氯仿抽提，异丙醇沉淀，回收总 ＲＮＡ，贮存于一７０℃待用。以１％琼脂糖凝胶电泳 和紫外分光光度计Ａ２６０／Ａ２８０鉴定ＲＮＡ纯度和浓 度。取约１ ｇ总ＲＮＡ，进行反转录。反转录条件 为：４２％６０ ｍｉｎ，９９℃２ ｍｉｎ，４℃保存。ＡＮＰ的引物 序列（５，＿３ ）为ＧＧＣ ＴＣＣ ｒｒＩ１Ｃ ＴＣＣ ＡＴＣ ＡＣＣ ＡＡ ＴＧＴ ＴＡＴ ＣＴＴ ＣＧＧ ＴＡＣ ＣＧ，内参ＧＡＰＤＨ的引物序 列（５ －３ ）为ＣＡＡ ＡＧＴ ＴＧＴ ＣＡＴ ＧＧＡ ＴＧＡ ＣＣＡ ＴＧＧ ＡＧＡ ＡＧＧ ＣＴＧ ＧＧ。上述引物由大连宝信生 中国药理学通报Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ２０１２ Ｊｕｎ；２８（６） ‘８４９・ 物有限公司合成，灭菌水溶解并配制成１００ ｉｘｍｏｌ・ Ｌ 的上下游引物混合液，使用浓度为２０ ｍｏｌ・ 。。底物溶液中，大约２～３ ｍｉｎ就可以显色，用水冲洗 终止反应，照像。分析阳性（显色）条带的分子量大 ＰＣＲ反应条件：预变性９４℃４ ｍｉｎ，变性９４℃ ４５ Ｓ，退火６０ｃＩ＝４５ Ｓ，延伸７２￣Ｃ ４５ｓ，终末延伸７２℃ ５ ｍｉｎ，４￣Ｃ终止，３２循环。循环扩增结束后，取１０ ｌ 产物进行２％琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后，置于 凝胶成像系统进行观察和分析。 １．７心肌细胞内［Ｃａ ］；的测定 将细胞按１× １０ ・Ｌ 密度种植于共聚焦专用培养皿，常规培养 小，而且根据信号强弱分析蛋白表达的量。 １．９倒置相差显微镜观察细胞形态变化 将倒置 相差显微镜置于有机玻璃保温箱内，箱内采用恒温 气体对流装置，使观测中的培养板始终为３７℃恒温 气流覆盖。用放大倍数为２００倍目镜观察心肌细胞 形态。 １．１０统计学处理采用ＳＰＳＳ １３．０统计软件进行 ４８ ｈ后，随机分组进行试验：将细胞用Ｄ．ｈａｎｋｓ’液 洗３次，用终浓度为５ ｔｘｍｏｌ・Ｌ 的ＦＬｕｏ－３／ＡＭ ３７℃避光孵育细胞３０ ｍｉｎ，然后吸出染液，再以Ｄ— Ｈａｎｋｓ’，液洗３次，每孔加人０．４ ｍｌ Ｄ—ｈａｎｋｓ’液，将 培养板置于ＡＣＡＳ５７０载物台上，在激光共聚焦显微 镜下动态扫描细胞内荧光强度的变化。参数设置如 下：激发波长４４８ ｎｍ，发射波长５３０ ｎｍ，连续扫描２ ｍｉｎ。对同一细胞先扫描记录一段正常波动曲线，再 加人１０ ｉｘｍｏｌ・Ｌ Ｉｓｏ，平衡３ ｍｉｎ后，记录细胞内 荧光强度的变化，并由计算机进行处理。细胞内游 离钙离子浓度变化用给药前后荧光强度变化计算： ［ｃａ ］；变化百分率＝［（Ｆ—Ｆ。）／Ｆ。］×１００％，其中 Ｆ表示刺激后的荧光强度，Ｆ。表示静息状态的荧光 强度。共聚焦系统由Ｌｅｉｃａ公司提供的软件控制， 每孔选２～３个视野，以平均荧光强度变化问接反映 细胞内游离钙离子浓度的相对水平 。 １．８ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法测ＣａＮ表达水平 准备样 品，用ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分离蛋白。用一张滤纸，剪成与胶 同样大小，在电转移缓冲液中预湿，放在Ｓｃｏｔｃｈ— Ｂｒｉｔ Ｐａｄ上，在胶的阴极端放上滤纸，胶的表面用电 泳转移缓冲液浸湿，排出所有气泡。在胶的阳极面， 放置同样大小浸湿的纤维素滤膜，排出气泡， 再于滤膜的阳极端放置一张滤纸，排出气泡，再放 一个Ｓｃｏｔｃｈ－Ｂｒｉｔ Ｐａｄ。将以上“三明治”样装置放入 一个塑料支撑物中间，将支撑物放入电转移装置 中，加入电转移缓冲液，接通电源，使胶上的蛋白 转移至纤维素滤膜上，电压为１４ Ｖ，４ 转移１ ｈ或者过夜，将滤膜放人丽春红ｓ溶液中５ ｍｉｎ，蛋 白染色，水中脱色２ ｍｉｎ，照像，用印度墨水将分子 量标准染色，在水中完全脱色，将滤膜放在塑料袋 中，每３张加入５ ｍｌ封闭缓冲液，封闭特异性抗体 结合位点，室温１ ｈ，摇动，倒出封闭缓冲液，在封 闭缓冲液中稀释第一抗体，室温下放置１ ｈ，将滤 膜转到塑料盒中，用２００ ｍｌ ＰＢＳ洗４次，摇动，在 封闭缓冲液中稀释辣根过氧化物酶标记的二抗，重 复上一个步骤，将滤膜放在１００ ｍｌ新鲜配置的ＤＡＢ 数据统计。所有数据均以 ±ｓ表示统计学处理采 用单因素方差分析及ＬＳＤ法。 ２结果 ２．１ 不同处理因素对Ｉｓｏ诱导的大鼠乳鼠心肌细 胞蛋白含量的影响分组加入不同处理因素后测各 孔细胞ＯＤ值。Ｉｓｏ（１０ Ｉｘｍｏｌ・Ｌ ）组与对照组相比 明显增加；单用Ｒ—ＰＩＡ（１ Ｉｘｍｏｌ・Ｌ ）、ＣＳＡ（１ ｐ￣ｍｏｌ ・Ｌ。。）、Ｒｐ—ｃＡＭＰＳ（１ ｐ￣ｍｏｌ・Ｌ ）均可明显抑制Ｉｓ０ 诱导的心肌细胞蛋白含量增加，且３组相比差别无 统计学意义，表明ＣＳＡ（１ Ｉｘｍｏｌ・Ｌ ）、Ｒｐ．ｃＡＭＰＳ （１ ｍｏ１．Ｌ ）对Ｉｓｏ诱导的心肌细胞蛋白含量增 加的抑制程度与Ｒ．ＰＩＡ相似；而Ｉｓｏ＋ＰＴＸ＋Ｒ．ＰＩＡ 组与模型组（Ｉｓｏ组）相比，差别无统计学意义，表明 ＰＴＸ可以阻断Ｒ—ＰＩＡ对Ｉｓｏ诱导的心肌肥大细胞蛋 白含量增加的抑制作用。 Ｆｉｇ １ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｇｅｎｔｓ ｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｍｙｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｎｅｏｎａｔａｌ ｒａｔｓ（ ±ｓ，ｎ＝６） １：Ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ；２：ＣＳＡ（１ ｐ，ｍｏｌ・Ｌ ）ｇｒｏｕｐ；３：Ｉｓｏ（１０ ｒｎＩＪｌ・ Ｌ ）ｇｒｏｕｐ；４：Ｉｓｏ（１０ Ｉｘｍｏｌ・Ｌ ）＋Ｒｐ—Ｃａｍｐｓ（１ Ｉｘｍｏｌ・Ｌ ）ｇｒｏｕｐ； ５：Ｉｓｏ（１０ ｐ￣ｍｏｌ・Ｌ ）＋ＣＳＡ（１ ｐ．ｍｏｌ・Ｌ‘。）ｇｒｏｕｐ；６：Ｉｓｏ（１０ Ｉ．￣ｍｏｌ・ Ｌ一 ）＋Ｒ—ＰＩＡ（１ Ｉｘｍｏｌ・Ｌ～。）ｇｒｏｕｐ；７：Ｉｓｏ（１０ Ｉ．￣ｍｏｌ・Ｌ一 ）＋ＣＳＡ（１ ｐ￣ｍｏｌ・Ｌ ）＋Ｒ—ＰＩＡ（１ ｐ￣ｍｏｌ・Ｌ ）ｇｒｏｕｐ；８：Ｉｓｏ（１０ ｐ，ｍｏｌ・Ｌ ）＋ ＰＴＸ（５ ｍｇ・Ｌ ）＋Ｒ－ＰＩＡ（１ Ｉｘｍｏｌ・Ｌ ）ｇｒｏｕｐ．一Ｐ＜０．０１ ｃｏｎ－ ｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ； Ｐ＜０．０ｌ ＩＳＯ（１０ ｐ￣ｍｏｌ・Ｌ一 ）ｇｒｏｕｐ； Ｐ＜０．０５ ＩＳＯ （１０ ｔｘｍｏｌ・Ｌ ）＋Ｒ－ＰＩＡ（１ ｐ￣ｍｏｌ・Ｌ ）ｇｒｏｕｐ． ・８５２・ １ ］ｊ中国药理学通报］＿］ ＪＣｈｉｎｅｓｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ２０１２ Ｊｕｎ；２８（６） ］Ｊ １Ｊ １ ｊ］ｊ 肌细胞肥大［Ｊ］．中国药理学通报，２０１０，２６（４）：５３１—５． Ｈａｎ Ｙ Ｌ，Ｙａｎｇ Ｙ Ｈ，Ｗａｎｇ Ｈ Ｘ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ａｌ ｒｅｅｅｐ－ ［８］Ｌｕ Ｍ Ｌ，Ｗａｎｇ Ｈ Ｘ，Ｚｈａｎｇ Ｌ，ｅｔ １ａ．Ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ ｓｉｇ． ｎａｌ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｋ—ｏｐｉｏｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｎ ｍｙｏｅａｒｄｉｅａｌ ｈｙｐｅｒｔｏｐｈｙ ｉｒｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｉｓｏｐｒｅｎａｌｉｎｅ ｉｎ ｎｅｏｎａｔａｌ ｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｇｌｕｃｏｓｅ—ｉｎｄｕｃｅｄ ｅａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ［Ｊ］．Ｃｈｉｎ Ｐｈａｒｎｍ￣ｏｌ Ｂｕｌｌ，２０１０，２６（４）：５３ｌ一５． Ｔａｎｇ Ｘ Ｌ，Ｗａｎｇ Ｈ Ｘ，Ｃｈｏ Ｃ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｒｅｄｕｃｅｄ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ ｒａｔｓ［Ｊ］．Ｃｈｉｎ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ，２０１０，３（６）：１８０—４． ［９］ Ｋｅｖｅｌａｉｔｉｓ Ｅ，Ｐａｙｎｅｔ Ｊ，Ｍｏｕａｓ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｏｐｅｎｉｎｇ ｏｆ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌｓ：ｔｈｅ ｃｏｍｍｏｎ ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｌｉｎｋ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎ— ［ｃａ ］ｉ ｔｏ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ａ１－ａｎｄ Ａ２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｉｓｏ— ｐｒｏｔｅｒｅｎｏｌ・ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｖｅｎｔｉｃｕｌｆａｒ ｍｙｏｃｙｔｅｓ ｏｆ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｈｙｐｅｒ－ ｉｎｇ ａｎｄ ｎａｔｕｒａｌ ｈｉｂｅｒｎａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１９９９，９９（２３）：３０７９ —ｔｅｕｓｉｖｅ ｒａｔｓ［Ｊ］．Ｊ Ｃａｒｄｉｏｖａｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１９９８，３１：４９３—８． Ｆｒｅｙ Ｎ，ＭｃＫｉｎｓｅｙ Ｔ Ａ，Ｏｌｓｏｎ Ｅ Ｎ．Ｄｅｃｏｄｉｎｇ ｃａｌｃｉｕｍ ｓｉｇｎａｌｓ ｉｎ－ ８５． ［１０］Ｂｒｉｔｔｓｎ Ａ ａＧ，Ｇｉｎｓｂｕｒｇ Ｋ Ｓ，Ｃｈｕ Ｇ，ｅｔ １ａ．Ｃｈｒｏｎｉｃ ＳＲ Ｃａ２ 一ＡＴ． Ｐａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｃａｕｓｅｓ ａｄａｐｔｉｖｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃａ２ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｃａｒｄｉａｃ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｗｉｎｅ，２０００， ６（１１）：ｔ２２１—７． ［Ｊ］．Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ，２００３，９２（７）：７６９—７６． ［１１］Ｋｕｄｏｈ Ｓ，Ａｋａｚａｗａ Ｈ，Ｔａｋａｎｏ Ｈ，ｅｔ １ａ．Ｓｔｒｅｔｃｈ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｅ— ｏｎｄ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒｓ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｅｙｔｅｉｏｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ［Ｊ］．Ｐｒ０ｇ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２００３，８２（１３）：５７—６６． 张飞云，吴先均．文秀华，等．心肌肥厚机制研究进展［Ｊ］．心血 管病学进展，２００５，２（４）：１９７—２００． Ｚｈａｎｇ Ｙ Ｆ，Ｗｕ Ｘ Ｊ，Ｗｅｎ Ｘ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ Ｈｙｐｅｒｔｏｒｐｈｙ［Ｊ］．Ａｄｖ Ｃａｒｄｉｏｖａｓ Ｄｉｓ， ２００５，２（４）：１９７—２００． Ｈｏｇａｎ Ｐ Ｇ，Ｃｈｅｎ Ｌ，Ｎａｒｄｏｎｅ Ｊ，Ｒａｏ Ａ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ［１２］Ｗａｎｇ Ｈ Ｘ，Ｋｗａｎ Ｃ Ｙ，Ｗｏｎｇ Ｔ Ｍ．Ｅｌｅｃｔｉｒｃａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕ－ １ａｒ Ｃａ２ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｖｅｎｔｉｃｕｌａｒｒ ｍｙｏｃｙｔｅｓ：ａ ｕｓｅｆｕｌ ｐａｒａｍｅ— ｔｅｒｆｏｒｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｃａｒｄｉａｃ ｄｒｕｇｓ［Ｊ］．ＣｌｉｎＥｘｐＰｈａｒｍａ￣ｏｌＰｈｙｓｉｏｌ， １９９９，２６（１０）：８３５—６． ｂｙ ｃａｌｃｉｕｍ，ｅａｌｅｉｎｅｕｒｉｎ，ａｎｄ ＮＦＡＴ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，２００３，１７ （１８）：２２０５—３２． Ｚｏｕ Ｙ，Ｙａｏ Ａ，Ｚｈｕ Ｗ，ｅｔ ａ１．Ｉｓｏｐｒｏｔｅｒｅｎｏｌ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓ ｉｎ ｃａｒｄｉ ｏｍｙｏｅｙｔｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｃａｌｃｉ— ［１３］荆黎，杨育红，王洪新，吴国强．腺苷Ａ，受体激动抑制心肌 细胞肥大［Ｊ］．中华高血压杂志，２００８，４（５）：３４９—５３． ［１３］Ｊｉｎｇ Ｌｉ，ＹａｎｇＹＨ，ＷａｎｇＨ Ｘ，ｗｕ ＧＱ．Ｅｆｆｅｃｔｓａｎｄｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ａ１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｇｏｎｉｓｔ ｏｌｌ ｉｓｏｐｒｏｔｅｒｅｎｏｌ ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｙｐｅｒｔｒｏ— ｎｅｕｒｉｎ［Ｊ］．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２００１，１０４（１）：１０２—８． 鲁美丽，王洪新，张蕾，等．钙调磷酸酶信号通路参与 －阿片 ｐｈｙ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｎｅｏｎａｔａｌ ｒａｔｓ ｍｙｏｃａｒｄｉｌａ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｃｈｉｎ Ｊ Ｈｙｐｅｒ－ ｔｅｎｓ。２００８，４（５）：３４９—５３． 受体激动对异丙肾上腺素诱导的乳大鼠心肌细胞肥大的抑制 作用［Ｊ］．中国药理学与毒理学杂志，２０１０，３（６）：１８０—４． Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ａｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｏ ｔｈｅ ｍｙｏｃａｒｄｉｃａｌ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｉｓｏｐｒｅｎａｌｉｎｅ ｉｎ ｎｅｏｎａｔａｌ ｒａｔｓ ｂｙ ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ ｓｉｇｎａｌ ｐａｔｈｗａｙｓ ＸＩＮＧ Ｌｉｎｇ ，ＹＡＮＧ Ｙｕ．ｈｏｎｇ 一，ＷＡＮＧ Ｈｏｎｇ．ｘｉｎ ，ＬＵ Ｍｅｉ—ｌｉ ， （１．Ｄｅｐｔ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ Ｌｉａｏｎｉｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ；２．Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｒｕｇｓ ｏｆＬｉａｏｎｉｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｊｉｎｚｈｏｕ Ｌｉａｏｎｉｎｇ １２１００１，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｉｍ Ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａ。 Ｆｌｕｏ－ ， Ｍ ａｓ ｆｌｏｕｒｅｓｅｃｅｎｔ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ．Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｘ— ｄｅｎｏｓｉｎｅ Ａ１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｎ ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ（ＣａＮ） ｓｉｇｎａｌ ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｎ ｉｓｏｐｒｏｔｅｒｅｎｏｌ—ｉｎｄｕｃｅｄ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｃｅｉｌｓ ｆｒｏｍ ｎｅｏ— ｎａｔａｌ ｒａｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｎｅｏｎａｔａｌ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｔｈｅ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ ｍｙｏｃｙｔｅｓ ｗｅｒｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｉｓｏ １０ ｐ￣ｍｏｌ・Ｌ～ｂｅｆｏｒｅ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ａ１ ｒｅ— ｃｅｐｔｏｒ ａｇｏｎｉｓｔ Ｒ－ＰＩＡ １ ｐ￣ｍｏｌ・Ｌ～ｗａｓ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ． ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣａＮ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ．Ｒｅ－ ｓｕｉｔｓ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｎｏｒｍａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，１ ０ ｐ￣ｍｏｌ －Ｌ Ｉｓ０ ｃｏｕｌｄ ｉｎｄｕｃｅ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ． Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ Ｉｓｏ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ，１ Ｉ￣ｍｏｌ・Ｌ～Ｒ—ＰＩＡ ｃｏｕｌｄ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔ Ｉｓｏ・－ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏ－－ ｔｅｉｎ ｃｏｎｔｅｎｔ，ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ ｖｏｌｕｍｅ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣａＮ，ａｎｄ ｃａｌｃｉｕｍｉｏｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ Ｔｈｅ ａｎｔｉｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ａ１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｃｉｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ＣｓＡ ａｎｄ Ｒｐ－ｃＡＭＰＳ．Ｂｕｔ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｒ—ＰＩＡ ｗｅｒｅ ｌｏｓｔ ｗｈｅｎ ｐｒｅｉｎｃｕｂａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＰＴＸ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ａ１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃａｎ ｉｎｈｉｂｉｔ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｉｓｏ ｔｈｒｏｕｇｈ ｄｅ— ｃｒｅａｓｉｎｇ ＣａＮ ｓｉｇｎａｌ ｐａｔｈｗａｙｓ ａｎｄ Ｃａ“． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ；ａｄｅｎｏｓｉｎｅ；ｉｓｏｐｒｏ— Ａ（ＣｓＡ）１ ｐ￣ｍｏｌ・Ｌ～，ｃＡＭＰ ｔｒｉｅｔｈｙｌ—ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓａｌｔ （Ｒｐ—ｃＡＭＰＳ）１ ｐ￣ｍｏｌ・Ｌ～，ａｎｄ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓｔｏｘｉｎ（ＰＴＸ） ５ ｍｇ・Ｌ一．Ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｔｅｎｔ ｗａｓ ａｓｓａｙｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｌｏｗｒｙ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍＲＮＡ ｏｆ ａｔｒｉａｌ ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ（ＡＮＰ）ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ＲＴ—ＰＣＲ． ｔｅｒｅｎｏｌ；ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ；［ｃａ“］ｉ；ＡＮＰ ［Ｃａ ］；ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｕｓｉｎｇ
