质粒DNA电泳的三条带

质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。作为一个具有自身复制起点的复制单位于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。

从宿主细胞中提取质粒DNA，是DNA重组技术中最基础的实验技能。分离质粒DNA有三个步骤：

1、培养细菌使质粒扩增 2、收集和裂解细菌 3、分离和纯化质粒DNA

碱裂解法是较常用的提取的方法。其优点是得率高，适合于大多数的和菌株，所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。此法采取酸碱度高达Ph12.6的碱溶液使DNA发生变性。由于质粒和主染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，但仍然缠绕在一起不分开；而后者完全变性分，甚至出现断裂。因此，当加入中和液时，溶液Ph值恢复较低的近中性水平，此时， 质粒的两条小分子单链可迅速复性，恢复双链结构，但是主染色体DNA则无法复性。在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，杂质等缠绕一起被沉淀，而可溶性的质粒DNA留在上清夜中。

在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒DNA链发生断裂。所以，多数 质粒粗提取物中含有三种构型的质粒：

共价闭合环状DNA（cccDNA）： 质粒的两条链没有断裂；超螺旋 开环DNA（ocDNA）： 质粒的一条链断裂；松弛的环状分子 线形DNA（lDNA）： 质粒的两条链均断裂；线性分子

质粒DNA的分子构型

(a)松弛线性的DNA；

(b)松弛开环的OC构型； (c)超螺旋的SC构型

三、材料、试剂及器具 1、材料

E.coliDH 5α（pUC 19 vector） 2、试剂 1)LB培养基 2)TE缓冲液

3)裂解液：溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ 4)酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）

质粒DNA琼脂塘凝胶电泳模式图

由于琼脂糖中加有嵌入型染料溴化乙锭，因此，在紫

外线照射下DNA电泳带成橘黄色。

(a)道中的SC DNA走在最前沿，OC DNA则位于凝

胶的最后边；

(b)道中的L DNA 是经核酸内切酶切割质粒之后产生的，它在凝胶中的位置介于OC DNA 和 SC

DNA 之间

5)无水乙醇 6)70%乙醇

7)氨苄青霉素50mg/mL 器具

离心机、离心管、吸嘴 四、操作步骤

以1%比例把E.coliDH5α(含PUC18)接种于含氨苄青霉素（Amp）100μg/ml)的LB培养基

中37℃振摇过夜（12-18h）

↓

取1.5ml培养物置离心管中

↓

10000rpm,离心1min，或4000rpm，离心5-10min

↓

去上清，倒扣干净吸收纸上吸干

↓

沉淀+100μL溶液Ⅰ

↓

加或不加入少量溶菌酶粉末；混匀，室温放置10min

↓

+加200μL溶液Ⅱ（新鲜配置）

↓

温和颠倒数次，混匀，冰上放置5min

↓

+150μl溶液Ⅲ→颠倒混匀，冰上放置15min

↓

离心12000rpm,15min

↓

上清液+等体积酚：氯仿：异戊醇振匀，12000rpm,离心5min

↓

小心转移上层至一新的离心管弃下层有机相和中层蛋白质

↓

上清液+2倍体积无水乙醇混匀，室温5min-10min

↓

12000rpm,5min-15min

↓弃上清 沉淀+1mL70%乙醇

↓

12000rpm离心5min-15min

↓

弃上清；并倒扣离心管使液体流干

↓+

自然干燥或真空抽干（看不到液滴为宜）

↓

加50μlTE缓冲液（20μg/mlRNaseA）溶解质粒粗取物

↓ -20℃保存

六、实验报告

检查、保存提取的质粒，要求记录实验现象并说明原因。 七、思考题

分析以下试剂的作用原理： 溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖

5mmol/Ltris HCL (Ph 8.0) 10mmol/L EDTA(PH8.0) 溶液Ⅱ:0.4mol/L NaOH 2% SDS 使用前新鲜配制

溶液Ⅲ：5mol/L Kac 60 mL 冰醋酸11.5 mL 水28.5 mL

RNase A酶：将粉末溶于10mmol/L tris HCL (Ph7.5)、15mmol/L NACL中，配成10 mg/mL 浓度的酶液，于100℃水浴加热15 min，缓慢冷却至室温，-20℃保存 氯仿 无水乙醇