２０１３第２期 养猪ＳＷＩＮＥ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ｌ０３ 实时荧光ＲＴ—ＰＣＲ检测屠宰猪肺脏中猪繁殖 与呼吸综合征病毒变异株及相关思考 李儒曙 （珠海市动植物防疫监督检验中心，广东珠海中图分类号：￥８５８．２８５．３ 文献标志码：Ａ ５１９０１５） 文章编号：１００２—１９５７（２０１３）０２—０１０３—０２ 摘要：采集检疫合格、临床健康的活大猪入场屠宰后的肺脏１６０份，采用实时荧光ＲＴ—ＰＣＲ方 法，检测猪繁殖与呼吸综合征病毒Ｎｓｐ２ １ ５９４－１ ６８０变异株，共检出９份阳性样品，阳性率为 ５．６％，试验结果证明，猪繁殖与呼吸综合征病毒Ｎｓｐ２ １ ５９４－１ ６８０变异株并不一定导致猪发病。 关键词：实时荧光ＲＴ—ＰＣＲ；屠宰猪；猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株 猪繁殖与呼吸综合征病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ 限公司；ＲＮＡ提取试剂ＴＲＩＺＯＬ购自深圳太太基因 ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ８ｖｎｄｒｏｍｅ ｖｉｒｕｓ，ＰＲＲＳＶ）为第ｌ０次国 工程有限公司。 际病毒大会上设立的动脉炎病毒科动脉炎病毒属 １＿３主要仪器 成员，不同年龄、品种和性别的猪均能感染，以妊娠 荧光ＰＣＲ仪为美国Ｂｉｏ—ｒａｄ公司产品。 母猪和１月龄以内的仔猪最易感，临床上以引起母 １．４样品制备 猪流产，产死胎、弱胎、木乃伊胎以及仔猪呼吸困难、 每份猪肺脏样品分别从３个不同的位置取组织约 败血症、高死亡率为主要症状『１１。猪繁殖与呼吸综合 ｌ ｇ，用手术剪剪碎混匀后取０．０５ ｇ到研磨器中研磨， 征病毒变异株通常被认为是经典的猪繁殖与呼吸综 合征病毒非结构蛋白Ｎｓｐ２缺失３０个氨基酸从而形 成高致病性毒株，并导致自２００６年夏以来席卷我国 大部分省份的所谓“高热病” 。 本研究没有按常规方法采集疑似高致病性猪 繁殖与呼吸综合征发病猪的病料做病原检测，而是 采集屠宰场里健康活大猪屠宰后的肺脏做猪繁殖与 呼吸综合征病毒变异株的检测，检测结果发现，临床 健康的活大猪部分携带有猪繁殖与呼吸综合征病毒 变异株，该结果为研究猪繁殖与呼吸综合征以及防 控“高热病’提供了新依据。 ｌ材料与方法 １．１检测样品 加入１５ ｍＬ生理盐水继续研磨，待匀浆后转至１．５ ｍＬ 洁净离心管中，８ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心２ ｒａｉｎ，取上清１００ ＬＬＬ到１．５ ｍＬ灭菌无ＲＮＡ酶污染的离心管中备用。 １．５病毒总ＲＮＡ提取 将制备好的样品，每管加入６００ ＩｘＬ ＴＲＩＺＯＬ裂 解液，按照常规方法提取病毒总ＲＮＡ。获得的总 ＲＮＡ置一７０℃保存备用。 １．６实时荧光ＲＴ—ＰＣＲ检测 ２５ Ｌ的反应体系中，加入病毒总ＲＮＡ２．５ Ｌ， ＲＴ—ＰＣＲ反应液１４ Ｌ，酶混合液１．０此，荧光探针 １．０ Ｌ，无菌无核酸酶水６．５ ｔｘＬ，充分混匀后进行以 下反应：４２℃５ ｒａｉｎ，９５℃１０ ｓ；９５℃５ ｓ，６０℃３５ ｓ （收集ＨＥＸ荧光信号），４０个循环。 ２０１２年８—１０月，从珠海市西部某生猪定点屠 ２结果 １６０份肺脏检测出９份猪繁殖与呼吸综合征 宰场中，采集产地检疫合格、临床健康的活大猪进场 屠宰后的肺脏共１６０份，样品尽量在采集当日检测， 病毒变异株阳性样品，阳性率为５ 。检测曲线见图１。 不能当日检测的样品置一２０℃保存，１周内检测，初 次检测阳性样品置一７０℃保存备重检。 Ａｍｐｌｉｆｃｉａｔｉｏｎ Ｃｈａｒｔ ／ １．２检测试剂 ／ 猪繁殖与呼吸综合征病毒（Ｎｓｐ２ １ ５９４～１ ６８０ 变异株）实时荧光ＲＴ—ＰＣＲ检测试剂盒，批号：ＨＰ— ＰＲＳ２０ｌ２０６ｌ９Ｐ，购自北京世纪元亨动物防疫技术有 收稿日期：２０１３—０１—２３ ／ 阳性样品 ／ 阳性对照 ／ ＼ ／／ ， ， ： 夕，／ —— — ：＝： 阴性对照 ／ 作者简介：李儒曙（１９８０一），男，湖北黄石人，执业兽医师，硕士，主 要从事重大动物疫病风险评估、疫情预警及防控研究． Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｉｒｕｓｈｕ＠１６３．ｃｏｍ 。 加 幅 盘ｅ ２５ ∞ ３５ 图ｌ荧光ＲＴ—ＰＣＲ检测曲线 ４ｏ １０４ ３讨论 养猪ＳＷＩＮＥ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ（２） ２０１３ 格证明》做了明确规定，其中第（四）款规定：农业部规 （１）猪繁殖与呼吸综合征又称为“蓝耳病”，该 定需要进行实验室疫病检测的，检测结果符合要求。病在１９８７年美国的北卡罗来纳州首次发现，然后迅 而农业部却又未出台官方的文件细则规定在实施动 速向世界各地蔓延，除瑞典、新西兰等少数几个国家 物产地检疫过程中哪些动物疫病需要进行实验室检 迄今没发现外，世界上大部分地区都有该病的发生 测；在行业内也是按照惯例，对疑似患病动物才做进 和流行；中国于１９９６年由哈尔滨兽医研究所郭宝清 步实验室检验，这在一定程度上造成了现行的动 等首次分离到该病原 ，农业部在１９９９年第９６号公 物产地检疫的基本现状是，只关注动物临床表观状 告中将猪蓝耳病归于二类动物疫病。自２００６年以来 况及相关档案，实验室检测严重缺失，甚至在国内不 一我国多个省份暴发流行并造成大量生猪死亡的“高 少地方进行动物产地检疫时由于不知道究竟检什么 热病”的原发病原被许多学者认为是ＰＲＲＳＶ变异 内容而使动物检疫流于形式，更甚者出现只开证收 株（Ｎｓｐ２ １ ５９４～１ ６８０ ｂＤ缺失），２００７年３月农业部 兽医局根据实验病理学、免疫组化检测和回归动物 试验结果，也将猪“高热病”病原定为高致病性猪繁 殖与呼吸综合征病毒（ＨＰ—ＰＲＲＳＶ），随后在２００８年 农业部第１ １２５号公告中将高致病性猪蓝耳病列为 一类动物疫病，将猪蓝耳病仍归为二类动物疫病。 笔者认为，现已发现的很多动物病原根据不同的毒 株（或菌株、虫株）均有高致病性、低致病性或无致病 性的特点，因此，无需将一种动物疫病的名称按照其 致病性分成若干种叫法，现行的动物疫病分类合理 性值得商榷。本研究证实，ＰＲＲＳＶ非结构蛋白Ｎｓｐ２ 变异并非导致ＰＲＲＳＶ高致病性的充分条件，Ｎｓｐ２ １ ５９４～１ ６８０变异株也可能是低致病性或无致病性 的。有研究者通过反向遗传操作技术也证实，Ｎｓｐ２ 变异与ＰＲＲＳＶ高致病性或毒力并没有多少直接关 联，其致病性增强或高毒力的分子机制仍有待阐明［５１。 因此，将“高热病”的病因完全归咎于ＰＲＲＳＶ非结构 蛋白Ｎｓｐ２的变异并不准确。 （２）有一种可能是，经过近年来不断的强化免 疫，在免疫压力下或其它自然选择条件下，病毒完成 了适应环境的进化，部分原本高致病性的ＰＲＲＳＶ变 异株毒力已然减弱，并在猪群中以带毒不发病的现 状存在。 （３）还有一种可能存在，即本研究中检测到的 ＰＲＲＳＶ变异株虽对大猪没有致病性，却可能对１月 龄左右的小猪存在致病性。这需要分离病毒并进行 相关的攻毒实验。如果这种推测成立，那么大猪舍、 产房及保育舍之间的相互隔离就显得非常重要。 （４）本研究中检测到的这些低致病性或无致病 性ＰＲＲＳＶ变异株如果被证实具有很好的免疫原性， 那么它们可能将是优良的高致病性猪蓝耳病疫苗毒 株，值得深入研究。 （５）试验结果亦从流行病学上提示，在对猪群 进行ＰＲＲＳ免疫过程中，除了母猪和仔猪，对中大猪 的免疫也不可忽视。 （６）《动物检疫管理办法（农业部令２０１０年第６ 号）》第十四条对动物产地检疫及开具《动物检疫合 费不检疫的违规现象。鉴于实验室检测（特别是动物 病原学检测）在动物产地检疫上的缺失，继而产生对 产地检疫合格、临床健康带毒或带菌动物的防疫忽 视，或成为动物疫病防控中疏漏的重要一环，如本研 究中携带有高致病猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株 而临床健康的活大猪及其屠宰后的胴体、脏器，均有 可能成为动物传染病的传染源而被防疫者所忽略。 因此，进一步规范动物产地检疫行为，明确实验室检 测目标及其在动物产地检疫上的必要性，迫在眉睫！ 参考文献： ［１１ Ｃｈｏ Ｊ Ｇ，Ｄｅｅ Ｓ Ａ．Ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎ— ｄｒｏｍｅ ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，２００６，６６（３）：６５５—６６２． 【２］Ｋｅｇｏｎｇ Ｔｉａｎ，Ｘｉｕｌｉｎｇ Ｙｕ，Ｔｉｅｚｈｕ Ｚｈａｏ，ｅｔ ａ１．Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ Ｆａｔａｌ ＰＲＲＳＶ Ｖａｒｉａｎｔｓ：Ｕｎｐａｒａｌｌｅｌｅｄ Ｏｕｔｂｒｅａｋｓ ｏｆ Ａｔｙｐｉｃａｌ ＰＲＲＳ ｉｎ Ｃｈｉｎａ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｑｕｅ Ｈａｌｌｍａｒｋ［Ｊ］． ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２００７，２（６）：５２６． ［３１童光志，周艳君，郝晓芳，等．高致病性猪繁殖与呼吸综合征 病毒的分离鉴定及其分子流行病学分析 中国预防兽医学 报，２００７，２５（９）：３２３—３２７． 『４１郭宝清，陈章水，刘文兴，等．从疑似ＰＲＲＳ流产胎儿分离 ＰＲＲＳＶ的研究『Ｊ１．中国畜禽传染病，１９９６，８７（２）：１—５． ［５１蔡宝祥．我国高致病性猪繁殖与呼吸综合征研究进展ｆＪ］．畜 牧与兽医，２０１０，４２（１Ｏ）：１－４． （编辑：姜雪）
