·种子科技·
文章编号：1005-2690（2010）10-0019-03
··2010（10）
中图分类号：Q7
文献标志码：A
·专题综述·
DNA分子标记技术在农作物品种鉴定上的应用
李志勇，谢华峰，张力，赵磊
（河北省种子管理总站，河北石家庄050031）
摘
要：文章概述了利用DNA分子标记技术（RFLP、RAPD、SSR、AFLP、ISSR和STS等）进行品种鉴定的原理、特点和研
成本低、自动化、不受环境影响等优点，DNA分子标记技术在品究概况，从DNA分子水平上进行品种鉴定具有准确可靠、
种鉴定方面具有广阔的应用前景。关键词：DNA；分子；标记；品种；纯度；真实性；鉴定
优良品种在作物各种增产因素中占30%~40%。种子质量直接影响优良品种的增产效果，品种混杂和纯度降低会明显降低产量[1]。快速准确地鉴定品种和进行纯度分析对于种子质量标准化、品种审定、假种鉴别、产权纠纷均有重要作用[2]。目前，我国种子生产和经营管理还不太规范，不合格种子屡屡混入市场，造成减产和经济损失。因此，快速准确进行品种鉴定就显得尤为重要。多年来，品种纯度和真伪是以形态学标记为依据的[3]。这种方法虽简单经济，但周期长，花费大，不仅受季节，而且很多性状的表现受栽培措施及环境因子的影响，鉴定者的观察经验也制约着鉴定的准确性[4]。蛋白质电泳和同工酶电泳等生化标记鉴定法也曾被用来进行品种鉴定[5，6]。同工酶和种子贮藏蛋白均是基因的直接表达产物，它们的多样性能在一定程度上反映不同品种DNA组成上的差异。从遗传学角度上来看，品种纯度和真伪鉴定实质上是对品种基因型的鉴定。形态标记和生化标记均是基因表达产物的反映，鉴定品种真实性和纯度时是不够完美的。因此，只有通过直接鉴定品种的DNA分子本身才准确可靠[7]。DNA分子标记是DNA水平上遗传多态性的直接反映，可准确可靠地用来进行品种纯度和真实性鉴定。但是，利用DNA分子标记进行品种纯度和真实性的鉴定，首先要构建品种的标准DNA指纹图谱。目前，已构建的DNA指纹图谱主要有性片断长度多态性(Restrictionfragmentpolymorphism，简称RFLP)、随机扩增多态性DNA(RandomamplifiedpolymorphicDNA,简称RAPD)、简单序列重复(Simplesequencere-peat，简称SSR)、扩增片断长度多态性(Amplifiedfrag-mentlengthpolymorphism，简称AFLP)、内部简单序列重复(Inter-Simplesequencerepeat，简称ISSR)和序列标志位点(Sequencetaggedsite，简称STS)等。
小。不同来源的DNA有不同的性酶切位点，经酶切后形成的DNA片段大小的差异就是性片段长度多态性（RFLP）[8]。Smith利用RFLP技术，用38个探针成功地将78个玉米杂交种区分开，共得到288个RFLP标记[9]。Vacino等利用RFLP技术，用2个特异性的麦谷蛋白和麦醇溶蛋白探针，将54个意大利普通小麦品种区分开[10]。此外，RFLP标记技术先后在水稻、大麦、谷子、黄瓜、辣椒等园艺作物上得到广泛应用[11~13]。
RFLP标记技术的优点是标记量大，等位基因间共显性可区分纯合子和杂合子；缺点是工作量大，成本高，要求的DNA量大且纯度要高。2基于PCR的分子标记
PCR技术由美国K.Mullis于1983年发明，基于PCR技术的分子标记相继产生。
2.1
RAPD
由Willims、Welsh、McClelland等分别建立。用一种由10个核苷酸组成的随机引物，采用PCR技
1RFLP
RFLP技术最早是由Grodzicker建立的。其原理是检测DNA由性内切酶切后形成的DNA片段的大
作者简介：李志勇（1972-），男，河北省石家庄人。博士，高级农艺
师，从事种子管理工作。E-mail：braverylee@163.com。
术对基因组的几个区域进行扩增，产生大小不同的DNA，即为随机扩增多态性[14]。
余四斌等利用RAPD技术，对珍汕97B和明恢63及其组合汕优63进行了分析，结果表明，有一个引物AD04可将珍汕97B、明恢63及其组合汕优63区分开来，并能进行纯度鉴定，且比较了田间试验与RAPD结果，二者一致[15]。杨剑波等、邵启明等、陈洪等用RAPD标记技术在汕优63品种的纯度鉴定上也进行了研究[16~18]。陈一华等对12个优良玉米自交系的DNA进行了RAPD分析，建立了12个自交系的RAPD图谱，可用做品种纯度和真实性鉴定[19]。邱丽娟等利用RAPD标记技术分析了中国大豆和美国大豆种质，认为RAPD标记技术可有效区分大豆种质[20]。郭旺珍等在棉花上、许明辉等在烟草上用RAPD标记技术进行了分析，认为RAPD技术进行品种纯度鉴定是可行的[21，22]。
RAPD标记技术的优点是仅需少量DNA，简单快速，成本低；缺点是稳定性差，重复性不好，显性，不能鉴定杂合子。
·19·
·种子科技···2010（10）·专题综述·
2.2SSR
根据微卫星重复序列两端的保守序列设计引物，用PCR来扩增重复序列的多态性。SSR主要依赖于基本单元次数的变异，而这种变异在生物群体中是大量存在的。目前，SSR标记已广泛应用于种质鉴定等。李晓辉等利用58对引物对21份玉米骨干自交系及其组配的13杂交种进行了SSR分析，利用两个或三个引物组合构建的SSR图谱，通过统计测验可将13个杂交种区分开来，认为SSR技术可准确、快速地鉴定玉米杂交种种子纯度[23]。Senior等在4%Metaphor琼脂糖上检测了70对SSR引物对94个玉米自交系的扩增产物，共检测到365个等位基因变异[24]。
SSR标记的优点是具有大量的等位差异，多态性十分丰富，并且操作简便，稳定可靠；缺点是前期工作量大，必须开发大量的引物。
2.3
AFLP
由Zabeau等（1993）发明。通过对基因组DNA酶切片段的选择性扩增来检测DNA酶切片段长度的多态性。结合了酶切和PCR技术，可在一个反应内检测大量的性片段，具有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性。Smith等利用AFLP技术将44个玉米自交系分成不同类别，并认为AFLP是一种很准
确的方法，可以将亲缘关系非常近的品种区分开[25]。Weng等利用AFLP分析了来自半干旱热带作物国际研究所的10个花生品种，获得78个多态性谱带，认为AFLP是构建花生指纹图谱的有效方法[26]。
但是，AFLP技术操作复杂，成本较高，并且该项技术受到专利保护，只能用于非盈利性的科学研究。
2.4
ISSR
是由Zietkiewicz等发明的。以PCR扩增为基础，采用17-22碱基的重复锚定引物扩增重复序列之间的片段，既利用了基因组中丰富的SSR序列信息，同时又克服了RAPD、RFLP、AFLP和SSR技术等诸多缺
点，具有操作简单、标记重复性好、稳定程度高等优点。李进波等应用ISSR技术对12个水稻光温敏核不育系进行DNA指纹分析，选择3个多态性丰富的引物扩增出的8个多态性DNA片段可作为鉴定标记，能够正确区分供试的水稻品系，认为ISSR标记具有简便、快速、多态性丰富等优点，可用于进行品种鉴定[27]。李尚禹等运用ISSR技术，对吉林省主推6个玉米杂交种及其父本、母本共计18份基因图谱进行鉴别，从30条ISSR引物中选出4条扩增效果明显、特异性高的引物，结果表明，运用ISSR技术提高了玉米品种鉴定和纯度鉴定的准确性[28]。谢甫绨等采用ISSR分子标记技术对大豆品种(系)进行研究，结果表明，ISSR分子标记技术能很好地用来区分不同来源的大豆品种(系)[29]。
但是，ISSR与RAPD相似，不能鉴别检测位点的纯合与杂合状态。
·20·
2.5
STS
STS通过设计特定的引物，使其与基因组DNA序
列中特定位点结合，从而可用来扩增基因组中特定区域，分析其多态性。张建成等采用10份花生品种材料，对通过数据库查询设计合成的SSR引物和其他作者发表的SSR引物及STS引物进行了评估，并基于品种间简单匹配系数做了聚类分析，获得62个能产生多态性片段的SSR和STS引物对，总共获得427条带，对所采用的10份花生品种区分率达到100%，说明SSR和STS标记应用于花生品种鉴定有效[30]。D′ovidio利用STS标记对硬粒小麦品种进行了鉴定，认为STS方法对于干种子鉴定是一个合适的方法，而且可像蛋白质电泳那样成为标准方法[31]。
准确快速地进行品种鉴定是品种监督检验工作的重要基础。从理论上讲，利用DNA分子标记进行品种鉴定是切实可行的，但本文介绍的几种分子标记都不尽完美。下一步工作就是简化DNA分子标记技术的步骤，降低成本，实现自动化，从而使DNA分子标记技术得到更广泛的应用。
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·种子科技·
文章编号：1005-2690（2010）10-0021-03
··2010（10）
中图分类号：S513.038/062
文献标志码：A
·实验研究·
制种玉米多功能复混肥适宜用量与肥效的研究
闫治斌1，秦嘉海2，王爱勤3，吕彪2，赵芸晨2，肖占文2，裴晖平4，顾万东5
（1.甘肃敦煌种业玉门市种子公司，甘肃酒泉735000；2.河西学院农学系，甘肃张掖734000；3.中国科学院兰州化学物理研究所；4.北京德农种业张掖分公司；5.中国种子集团有限公司张掖分公司）
摘
要：在甘肃河西内陆灌区的制种玉米田内，通过田间试验，系统研究了制种玉米多功能复混肥的适宜用量及肥效，结果
表明：随着多功能复混肥施用量的增加，制种玉米经济性状和产量在增加，但增产量、边际产量、边际利润、肥料投资效率则随着施用量的增加而递减。多功能复混肥施用量与制种玉米产量间的肥料效应回归方程是：y=373.01+2.0x-0.00518x2。多功能复混肥适宜用量为80.02kg，制种玉米的理论亩产量为573.28kg，与田间试验处理5的结果基本吻合。在
磷纯养分投入量相等的条件下，不同种类肥料的肥效是：多功能复混肥＞尿素+磷二铵。氮、
关键词：制种；玉米；多功能；复混肥；经济性状；产量；效益
甘肃河西内陆灌区拥有得天独厚的自然条件和区位优势，吸引了中国种业、辽宁东亚、北京德农、奥瑞金、敦煌等90多家国内外种业集团，建立了玉米制种生产基地150万亩[1]，种子产业已发展为河西内陆灌区农民增收,农业增效的重要支柱产业之一。目前存在的问题是：制种玉米连作年限长，土壤养分比例失衡，缺素的生理性病害经常发生；有机肥投入量不足，化肥超量施用，土壤板结，贮水功能削弱；市场上流通的专
基金项目：甘肃科技支甘项目（1011JKCF180）
作者简介：闫治斌(1954-)，男，甘肃酒泉人，高级农艺师。研究方
向：植物营养与施肥。E-mail：qinjiahai123@163.com。通讯作者：秦嘉海（1954-），男，甘肃张掖人。教授，研究方向：植
物营养及施肥。E-mail：qinjiahai123@163.con。用肥有效成分比例不符合本区土壤养分现状和玉米对养分的吸收比例，且不具备保水、改土功效；导致制种玉米品质和产量下降，部分种业集团流向、内蒙和宁夏，影响了本区制种玉米产业的可持续发展。因此，研究和开发集营养、保水、保肥、改土为一体的制种玉米多功能复混肥成为复混肥研发的关键所在。本文针对制种玉米生产上存在的上述问题，采用作物营养平衡施肥理论和改土培肥理论，将土壤结构改良剂聚乙稀醇[2~9]与农业有机固体废弃物糠醛渣[10~12]、矿质元素、保水剂、生物菌肥按比例组合配制成制种玉米多功能复混肥，利用糠醛渣腐殖质的功能团吸附土壤养分，保水剂吸附土壤水分，聚乙烯醇与土壤颗粒粘合形成团粒结构，生物菌肥分解难溶性养分，将有机废弃物的
byRFLPandamplifiedfragmentlengthpolymorphisms(AFLP).[26]WengXJ,SantoshG，NiganSN.FingerprintinginGroundnut
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收稿日期：2010-08-16
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