(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 112378717 A(43)申请公布日 2021.02.19
(21)申请号 202011078043.3(22)申请日 2020.10.10
(71)申请人 中国科学院苏州生物医学工程技术
研究所
地址 215163 江苏省苏州市高新区科技城
科灵路88号(72)发明人 赵颖 梁伟国 孙海旋 王弼陡
黄梦璐 李富阳 (74)专利代理机构 北京远大卓悦知识产权代理
有限公司 11369
代理人 孔凡玲(51)Int.Cl.
G01N 1/28(2006.01)G01N 33/49(2006.01)
权利要求书1页 说明书8页 附图1页
CN 112378717 A(54)发明名称
两水平活化凝血检测试剂质控品及其制备方法
(57)摘要
本发明公开了一种两水平活化凝血检测试剂质控品的制备方法，包括以下步骤：1)获取动物血浆，检测动物血浆的R值、K值、Angle值、MA值；2)将动物血浆分两部分，在第一部分血浆中加入稀释液调节R值、K值、Angle值、MA值得到第一水平血浆；在第二部分血浆中加入吸附剂调节R值、K值、Angle值、MA值得到第二水平血浆；3)向所述步骤2)得到的第一水平血浆和第二水平血浆中分别加入含凝血因子保护剂的血浆缓冲液，得到两水平活化凝血检测试剂质控品。本发明提供的质控品不仅弥补了活化凝血检测试剂质控品市场的空白，还提供了两水平的试剂质控品，使得R、MA均具有很好的区分度，更能有效反应试剂的准确性和稳定性。
CN 112378717 A
权 利 要 求 书
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1.一种两水平活化凝血检测试剂质控品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)获取动物血浆，检测动物血浆的R值、K值、Angle值、MA值；2)将动物血浆分两部分，在第一部分血浆中加入稀释液，调节R值、K值、Angle值、MA值，使得：6＜R≤10，29＜MA≤35，高岭土试剂孵育后的各参数范围为：2.5≤R≤5.5、0.0≤K≤3、65.0≤Angle≤84.4、29≤MA≤35；即得到第一水平血浆；
在第二部分血浆中加入吸附剂，混匀，离心后获得乏凝血因子血浆，调节R值、K值、Angle值、MA值，使得：15＜R≤22，40≤MA≤60，高岭土试剂孵育后的各参数范围为：6≤R≤10、0.0≤K≤3、60.0≤Angle≤82.2、40≤MA≤60；即得到第二水平血浆；
3)向所述步骤2)得到的第一水平血浆和第二水平血浆中分别加入含凝血因子保护剂的血浆缓冲液，调节pH，分装，冷冻干燥，即得两水平活化凝血检测试剂质控品。
2.根据权利要求1所述的两水平活化凝血检测试剂质控品的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中的动物血浆来源为猪、牛、羊、马、兔血浆中的一种或多种的混合血浆。
3.根据权利要求1所述的两水平活化凝血检测试剂质控品的制备方法，其特征在于，所述稀释液为含枸橼酸钠和氯化钠的水溶液，其中，枸橼酸钠的浓度为0.2-1wt％，氯化钠的浓度为0.09-0.9wt％。
4.根据权利要求1所述的两水平活化凝血检测试剂质控品的制备方法，其特征在于，所述吸附剂为硫酸钡。
5.根据权利要求4所述的两水平活化凝血检测试剂质控品的制备方法，其特征在于，所述硫酸钡添加的质量比为10％-40％，所述步骤2)中搅拌混匀时间为0.5-2h，离心转速为2000rpm/min，离心时间为20min。
6.根据权利要求1所述的两水平活化凝血检测试剂质控品的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中的含凝血因子保护剂的血浆缓冲液包括：100-500mM/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸、质量分数为5-30％的蔗糖、质量分数为5-20％的甘氨酸、质量分数为0.1-0.5％的Proclin。
7.根据权利要求6所述的两水平活化凝血检测试剂质控品的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中调节pH值至7.0-7.5。
8.根据权利要求1所述的两水平活化凝血检测试剂质控品的制备方法，其特征在于，所述第一水平血浆和第二水平血浆中加入的凝血因子保护剂的血浆缓冲液的体积分数均为10％。
9.一种如权利要求1-8中任意一项所述的方法制备得到的两水平活化凝血检测试剂质控品。
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CN 112378717 A
说 明 书
两水平活化凝血检测试剂质控品及其制备方法
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技术领域
[0001]本发明涉及临床凝血检验技术领域，特别涉及一种两水平活化凝血检测试剂质控品及其制备方法。
背景技术
[0002]血栓和出血一直是导致缺血性心脏病、中风和创伤性损伤的最大致命因素，因此及时诊断、疾病风险管理和抗血栓或抗凝血治疗的监测至关重要。传统凝血功能检测有活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原(FIB)、血小板聚集功能检测等。然而，这些传统凝血检验仅能检测凝血机制过程中的某一阶段，不能对凝血全貌如血液的聚集、凝血酶的形成以及血栓的溶解进行全面的分析，对血小板的作用及纤溶过程也无法评估，具有局限性。
[0003]血栓弹力技术是一种新的凝血功能检测手段，以全血为检测样本，用物理方法模拟体内环境下凝血及纤溶过程，迅速判断患者是否存在凝血功能异常并分析形成原因，被国内外广泛用于输血及药物治疗的监测，可以全面评估临床血栓或出血患者的整体凝血全貌。其中，活化凝血检测试剂以高岭土为主要原料，通过表面激活机制激发内源性凝血途径(XII)，从而使血样发生凝固。随着血凝块的形成、回缩或溶解，电脑控制的弹力图仪自动记录这些血样(全血、血浆、富含血小板的血浆)的动力学变化，形成的凝血图能够检测血凝块的形成、溶解及血凝块凝血功能的动态变化。因此，活化凝血检测试剂将直接影响临床评价结果，检测试剂的准确性和稳定性显得尤为重要，检测活化凝血试剂稳定性的质控品也就成了检测试剂临床应用的关键。目前，市场上暂无活化凝血检测试剂的质控品，其质量控制通常是用新鲜血液样本比对测试市售试剂盒与待测试剂盒，这种方式需要大量新鲜血液样本，血液的来源有限、不能长期保存，并且用到的市售试剂盒也比较多，成本较高，操作繁琐；市售的质控品大都是凝血质控品和血栓弹力图仪质控品。其中凝血质控品只是对常规凝血检测项目如APTT、PT两项进行临床实验质量评估，对于活化凝血检测试剂盒的适应性不理想，很难使R、K、angle、MA的各参数均落在理想范围内；而血栓弹力图仪器质控品R值比较短，往往只能用来质控血栓弹力图仪，无法实现对活化凝血检测试剂盒中试剂的质量控制。所以研制准确性高、稳定性好的质控品可弥补试剂质控品市场的空白，对临床疾病诊断有重要意义。
发明内容
[0004]本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种两水平活化凝血检测试剂质控品及其制备方法。本发明提供了一种制备方法简单、适应性强的两水平活化凝血检测试剂质控品，可同时同时从R和MA两个方面实现对高岭土试剂的质量控制，并且具有较好的稳定性，从而为临床和患者提供更准确、有保障的服务。[0005]为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：提供一种两水平活化凝血检测试剂质控品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
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CN 112378717 A[0006]
说 明 书
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1)获取动物血浆，检测动物血浆的R值、K值、Angle值、MA值；
[0007]2)将动物血浆分两部分，在第一部分血浆中加入稀释液，调节R值、K值、Angle值、MA值，使得：6＜R≤10，29＜MA≤35，高岭土试剂孵育后的各参数范围为：2.5≤R≤5.5、0.0≤K≤3、65.0≤Angle≤84.4、29≤MA≤35；即得到第一水平血浆；[0008]在第二部分血浆中加入吸附剂，混匀，离心后获得乏凝血因子血浆，调节R值、K值、Angle值、MA值，使得：15＜R≤22，40≤MA≤60，高岭土试剂孵育后的各参数范围为：6≤R≤10、0.0≤K≤3、60.0≤Angle≤82.2、40≤MA≤60；即得到第二水平血浆；
[0009]3)向所述步骤2)得到的第一水平血浆和第二水平血浆中分别加入含凝血因子保护剂的血浆缓冲液，调节pH，分装，冷冻干燥，即得两水平活化凝血检测试剂质控品。[0010]其中，R值：反应时间，是指血样开始运作至第一块可检测得到的血凝块(仪器扫描图上幅度＝2mm)形成所需的时间。R值因抗凝剂及凝血因子缺乏而延长，因血液呈高凝状态而缩短。
[0011]K值：血凝块的形成时间，是指从测量R值终点起(血凝块开始形成)至血凝块硬度达到某一固定水平(振幅＝20mm)的时间。因此，K值用来评估血凝块强度达到某一水平的速度或动力学特性。K值的缩短受增加的纤维蛋白原水平的影响，而受到血小板功能的影响则较小。
[0012]Angle值：血凝块逐渐形成的动力学特性，Angle与K时间密切相关，因为两者都是血凝块聚合速度函数。在血液处于低凝状态时，血凝块的最终状况是振幅达不到20mm(此时K无法确定)。因此，Angle比K时间更全面。[0013]MA值：最大振幅，用来评估已形成的血凝块的最大强度或硬度(最大切应系数)，影响血凝块强度的因素有两个，即纤维蛋白和血小板，其中血小板作用要比纤维蛋白大。[0014]优选的是，所述步骤1)中的动物血浆来源为猪、牛、羊、马、兔血浆中的一种或多种的混合血浆。血浆的获得可以是静脉或动脉穿刺采集并添加抗凝剂离心后获得的新鲜血浆，也可以是市售血浆解冻离心后的血浆。
[0015]本发明采用动物血浆制备凝血质控品，与人源血浆相比，不仅凝血因子更加稳定，而且还能够大幅度节约生产成本。[0016]优选的是，所述稀释液为含枸橼酸钠和氯化钠的水溶液，其中，枸橼酸钠的浓度为0.2-1wt％，氯化钠的浓度为0.09-0.9wt％。[0017]优选的是，所述吸附剂为硫酸钡。[0018]优选的是，所述硫酸钡添加的质量比为10％-40％，所述步骤2)中搅拌混匀时间为0.5-2h，离心转速为2000rpm/min，离心时间为20min。[0019]本发明中采用加入稀释液的方法来降低MA值，并以此调节R值，使得两水平质控品的R和MA值有很好的区分度。通过调节吸附剂的添加量、吸附时间，来实现对动物血浆R值的调节，使得依赖维生素K的内源性凝血因子沉淀下来，从而使两水平质控品R值具有更好的区分度，更有效反应出高岭土试剂的准确性。[0020]优选的是，所述步骤3)中的含凝血因子保护剂的血浆缓冲液包括：100-500mM/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸、质量分数为5-30％的蔗糖、质量分数为5-20％的甘氨酸、质量分数为0.1-0.5％的Proclin。[0021]优选的是，所述步骤3)中调节pH值至7.0-7.5。
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CN 112378717 A[0022]
说 明 书
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优选的是，所述第一水平血浆和第二水平血浆中加入的凝血因子保护剂的血浆缓
冲液的体积分数均为10％。
[0023]本发明还提供一种如上所述的方法制备得到的两水平活化凝血检测试剂质控品。[0024]本发明的有益效果是：[0025]本发明提供的质控品，不仅弥补了活化凝血检测试剂质控品市场的空白，还提供了两水平的试剂质控品，使得R、MA均具有很好的区分度，更能有效反应试剂的准确性和稳定性；
[0026]本发明不同于市售凝血质控品采用人源血浆制备质控品，而是采用动物血浆为原料制备质控品，不仅来源充足、生产成本低廉，方法工艺简单，适合规模化生产，而且该质控品无需额外添加纤维蛋白原、凝血因子等，均一性好，稳定性高；
[0027]本发明不同于现有通过冷沉淀提取纤维蛋白原或者额外加入血小板或纤维蛋白原方法改变MA和R值，而是通过对血浆进行稀释降低MA，吸附凝血因子延长R，以此方法来提高两质控水平的区分度，从而更好的模拟正常和异常两种血样，进一步更好地实现对试剂质控的质量控制；
[0028]本发明制备的质控品，提供了一种血浆凝血因子保护剂，不仅具有冻干赋形作用，而且能有效保护凝血因子活性，避免因冷冻、低温、干燥等诸多因素对凝血因子的破坏，使得冻干前后的R、K、Angle、MA各项参数无明显变化。附图说明
[0029]图1为质控水平I孵育前后血栓弹力图；[0030]图2为质控水平II孵育前后血栓弹力图。
具体实施方式
[0031]下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。[0032]应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
[0033]实施例1两水平活化凝血检测试剂质控品的制备[0034]1、取兔全血和3.8wt％的枸橼酸钠抗凝剂按照9:1体积比混合均匀，混匀后的全血离心分离血浆，离心转速为3000r/min，离心时间为10min，小心分离得上层血浆。取样(包括序号为1、2的两组)上机测试该血浆的血栓弹力图参数，测量结果如表1所示[0035]表1
序号RKAngleMA110.01.271.750.929.81.174.049.1
[0037]2、取步骤1得到的血浆60ml，加入35ml稀释液，混匀后得稀释血浆标记为血浆I，取样测试，测试结果如表2所示。其中，稀释液为0.2wt％的柠檬酸钠和浓度为0.09wt％的氯化钠溶液的混合溶液。[0038]表2
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[0036]
CN 112378717 A[0039]
说 明 书
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序号RKAngleMA18.31.868.933.728.01.971.132.5
[0040]由测试结果可知，加入稀释液后，MA降低，R值缩短。[0041]另取步骤1得到的血浆100ml，加入10g硫酸钡(吸附剂)，置于25℃下搅拌2h，结束后将其离心，离心转速为3000r/min，离心时间15min，得上层乏凝血因子血浆，标记为血浆II，取样测试，测试结果如表3所示。[0042]表3
[0043]
序号RKAngleMA117.54.141.151.2218.24.542.350.7
[0044]由测试结果可知，加入吸附剂后，部分凝血因子被吸附，使得血浆R值延长，而MA未发生明显变化。[0045]3、配制含凝血因子保护剂的血浆缓冲液：Hepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)200mM、质量分数为10％的蔗糖、质量分数为5％的甘氨酸、质量分数为0.1％的Proclin；盐酸调节pH值至7.4。按照缓冲液：血浆的体积比为1:9的比例，分别向血浆I、血浆II中添加该缓冲液，混匀，稳定后分别上机检测，检测包括血浆直接检测及用活化凝血检测试剂(高岭土试剂)孵育后检测，测试结果如表4和图1、图2所示：[0046]表4
序号RKAngleMA血浆I8.02.557.230.3血浆I-孵育后3.51.175.931.8血浆II16.23.543.752.4血浆II-孵育后8.51.668.351.2
[0048]由上述结果可看出，血浆I和血浆II孵育前后均落在预期范围内。图1为质控水平I(血浆I)孵育前后血栓弹力图，图2为质控水平II(血浆II)孵育前后血栓弹力图；(图中曲线1、曲线2分别为孵育前后的测试结果)。[0049]4、将上述加入缓冲液的血浆I和血浆II溶液进行分装，每瓶1mL，半盖瓶塞，用冻干机冻干，完成冻干程序后，压塞，取出，分别标记为质控I、质控II，即得到两水平活化凝血检测试剂质控品，2-8℃冷藏保存。
[0050]实施例2两水平活化凝血检测试剂质控品的性能测试[0051]1、外观检测：产品为类白色至淡黄色疏松固体，复溶后为均一澄清的溶液，无不溶物。
[0052]2、准确度检测：分别检测质控品I、II及质控品I、II经高岭土试剂孵育后的血栓弹力图参数。检测方法为：分别取质控I、质控II各2瓶，复温后加入1mL蒸馏水复溶，充分摇匀，室温静置10min。取上述复溶质控品340uL加入含20uL 0.2mol/LCaCl2溶液的测试杯中，检测血栓弹力图参数。同时，按照上述复溶方法复溶质控品I、II各1瓶，复溶后取340ul取加入待测高岭土试剂杯中，上下颠倒5次，静置5-10min。吸取340ul高岭土试剂激活的溶液加入
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说 明 书
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含20uL 0.2mol/LCaCl2溶液的测试杯中，检测血栓弹力图参数。重复上述步骤3次，测试结果如表5所示：[0053]表5
[0054]
[0055]
从表5可以看出，质控品I、II孵育前后的测试结果均落在预期范围内，并且冻干前
后的各项参数相差不大。[0056]3、精密度检测：分别取质控品I、II各10瓶，复温复溶后用高岭土试剂孵育，检测血栓弹力图参数，重复10次，测试结果分别如表6、表7所示：[0057]表6质控品I的检测结果
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[0059]
[0060]
表7质控品II的检测结果
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说 明 书
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[0061]
[0062]
从表6、表7中可以看出，两水平质控品的各项参数CV均在10％以内，稳定性好，可
有效应用于高岭土试剂的质量控制。[00]4、稳定性检测
[0065]开瓶稳定性检测；将质控品I、II复溶并在室温(15-25℃)条件下保存，定时取样，用高岭土试剂孵育后检测血栓弹力图参数，结果见表8：[0066]表8
[0063]
质控IRKAngleMA质控IIRKAngleMA0h3.41.277.532.80h8.01.970.348.92h3.11.576.332.52h8.02.369.749.h3.21.674.833.94h7.91.871.450.28h3.51.377.233.18h8.32.168.547.6
[0068]由上述结果可知，两水平质控品在开瓶8小时内，各项检测数值仍在预期范围内，因此该两水平质控品的开瓶稳定性符合临床检测时限8h的要求。[0069]长期稳定性检测：将质控品I、II在2-8℃下储存，分别于0、3、6、9、12、15、18个月时取出，复温复溶后用同批次高岭土试剂孵育后检测血栓弹力图参数，结果见表9所示：[0070]表9
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说 明 书
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质控IRKAngleMA质控IIRKAngleMA0个月3.11.577.132.20个月8.11.872.349.63个月3.21.576.933.63个月8.22.369.748.76个月3.11.675.332.16个月7.81.968.352.09个月3.31.475.332.69个月7.81.868.548.212个月3.21.377.731.812个月8.31.972.151.315个月3.41.576.233.915个月8.01.773.450.818个月3.21.475.832.518个月8.11.872.9.1
[0072]测试结果表明，两水平质控品稳定性好，有效期长，在2-8℃条件下可保存18个月，能有效降低活化凝血检测试剂质量控制的成本。[0073]尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
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CN 112378717 A
说 明 书 附 图
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图1
图2
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