果实菠萝蛋白酶米氏常数的测定CAU.ZHAOWULING目的学习凝胶过滤的方法学习酶促动力学的测定CAU.ZHAOWULING1测定果实菠萝蛋白酶酶活力的原理果实菠萝蛋白酶可以将蛋白质底物水解成大小不同的片段。加入三氯乙酸后，较大的片段形成不溶性沉淀，较小的片段可以溶解在三氯乙酸中。这些溶于三氯乙酸的小肽在275nm有吸收，测定蛋白酶水解液在275nm的吸收就可以计算出酶的活力。CAU.ZHAOWULING果实菠萝蛋白酶活力单位的规定在35℃pH7.2条件下，果实菠萝蛋白酶水解酪蛋白所产生的溶于三氯乙酸的小肽在275nm的吸收为0.0145，定为1个单位（unit U）。CAU.ZHAOWULING2凝胶过滤的原理葡聚糖凝胶是一些小珠，具有交联的网状结构。混合的蛋白质溶液通过这些小珠时，大分子不能进入网格，直接从小珠的间隙中流出。小分子可以进入网格，减慢了流出的速度。可以根据分子量把不同大小的蛋白质分开。CAU.ZHAOWULING凝胶装柱已经冲洗好的凝胶倒掉一些水，用玻棒搅起，灌入层析柱中。后面可以用滴管装柱。装好的柱床应该均匀，不断裂，没有气泡。讲义中要求一次装好，并不是说要把所有的凝胶一次倒入柱子中，而是说，在装柱的同时，不要安排其他的工作，装好柱子以后，再去做其他的工作。CAU.ZHAOWULING3分离纯化称取果实菠萝蛋白酶20g，用0.002M pH6.0磷酸缓冲液100ml溶解，放置15分钟后，离心。离心：12 000rpm，20分，4℃。离心结束后，记录上清液的体积。留一部分溶液作为样品1，-20℃保存备用。样品1反映的是酶在溶解时的状态。CAU.ZHAOWULING余下的样品分装在几个透析袋中，在0.002M pH6.0的磷酸缓冲液中透析5小时，透析温度为4℃。将透析过的上清液转入离心管；离心：12 000rpm，20分，4 ℃离心后测量上清液的体积。这一步得到的样品为样品2，反映了样品在透析这一步的状态。将样品2分装，-20℃保存备用。CAU.ZHAOWULING4上样、收集柱子平衡好之后，放出缓冲液，使缓冲液接近柱床的平面。取3ml样品，用滴管沿管壁轻轻加入，待样品完全进入柱床后，再加缓冲液。开始洗脱。加样后立即开始收集。CAU.ZHAOWULING蛋白质含量的计算公式蛋白质含量（mg/ml）= 1.45×A280-0.74 ×A260酶活力的计算公式酶活力（U/ml）= A275/0.0145 ×稀释倍数10分钟CAU.ZHAOWULING5酶活力测定1样品对照2%酪蛋白1.5ml 1.5mlEDTA-Cys缓冲液0.5ml 0.5ml保温10分钟酶液0.1ml 反应10分钟三氯乙酸2.5ml 2.5ml酶液0.1ml静置30分钟后过滤CAU.ZHAOWULING洗脱曲线用所得到的数据作图，作出洗脱曲线。蛋白质的曲线和酶活力曲线要画在一个图中。横坐标是管号，纵坐标用双坐标：一个纵坐标是蛋白质的含量；一个纵坐标是酶的活力。CAU.ZHAOWULING6合并洗脱液根据洗脱曲线，合并具有酶活力的洗脱液，这就是样品3。样品3反映了酶纯化的情况。测定样品3的体积、蛋白质浓度、酶活力，计算比活力，－20℃保存备用。CAU.ZHAOWULING米氏常数的测定配制不同浓度的底物；测定不同底物浓度下的反应速度；计算KM和Vmax。CAU.ZHAOWULING7配制底物用0.025 M pH7.2的磷酸缓冲液配制8个不同浓度的底物。配制时要计算好需要的底物和缓冲液的量，分别加入，混匀。不要用系列稀释的方法，系列稀释的方法可能会使误差放大。CAU.ZHAOWULING简化的方法测定速度只用不同底物浓度下反应的初速度作为反应的速度，测定反应的初速度只需要反应进行10分钟就可以了。所用的方法就是我们测定酶活力的方法。CAU.ZHAOWULING8测定Vmax和KMA275以AA275 vsTime275对时间做图，用所得的斜率计算反应速度。所得的速度是在这个底物浓度下的反应速度。斜率用相同的方法测定其他底物浓度下的反应速度。0'10'20'30'40'50'60'TimeCAU.ZHAOWULING9
