[19]中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公布说明书
[21]申请号200810239320.7
[51]Int.CI.
A01N 37/46 (2006.01)A01P 21/00 (2006.01)A01G 7/06 (2006.01)A01H 3/04 (2006.01)
[43]公开日2009年4月29日[22]申请日2008.12.10[21]申请号200810239320.7
[71]申请人中国农业大学
地址100094北京市海淀区圆明园西路2号[72]发明人段留生 李召虎 王晓冬 谢备涛 王汉霞
谭伟明 田晓莉 翟志席
[11]公开号CN 101416626A
[74]专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司
代理人关畅 任凤华
权利要求书 1 页 说明书 10 页
[54]发明名称
γ－氨基丁酸提高植物耐温度胁迫能力的新用途[57]摘要
本发明公开了γ－氨基丁酸的新用途。该用途是γ－氨基丁酸在提高植物耐温度胁迫能力中的应用。所述提高植物耐温度胁迫能力的方法为用γ－氨基丁酸对植物进行处理，所述处理的方法为浸种和/或叶面喷施。本发明还公开了γ－氨基丁酸在促进植物生长，和/或提高植物产量，和/或提高植物品质中的应用。试验证明，用一定浓度的γ－氨基丁酸通过种子处理、叶面喷施等方式，可提高农作物忍耐能力，减少高温、低温等温度胁迫带来的危害，减少产量损失。
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权 利 要 求 书
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1、γ-氨基丁酸在提高植物耐温度胁迫能力中的应用。
2、根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述提高植物耐温度胁迫能力的方法为用所述γ-氨基丁酸对植物进行处理，所述处理的方法为浸种和/或叶面喷施。
3、根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述γ-氨基丁酸的浓度为0.01-10mmol/L。
4、根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述温度胁迫为高温胁迫和/或低温胁迫。
5、根据权利要求1-4中任一所述的应用，所述植物为单子叶植物和双子叶植物；所述单子叶植物为小麦、玉米和水稻，所述双子叶植物为大豆和棉花。 6、根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述植物为小麦或水稻，所述温度胁迫为高温胁迫。
7、根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述植物为玉米，所述温度胁迫为低温胁迫。
8、根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述植物为棉花，所述温度胁迫为低温胁迫。
9、根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述植物为大豆，所述温度胁迫为低温胁迫。
10、γ-氨基丁酸在促进植物生长，和/或提高植物产量，和/或提高植物品质中的应用。
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说 明 书
γ-氨基丁酸提高植物耐温度胁迫能力的新用途
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技术领域
本发明涉及γ-氨基丁酸提高植物耐温度胁迫能力的新用途。背景技术
γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是生物体内一种重要的四碳非蛋白质氨基酸，广泛存在于原核与真核生物中。在动物体中，它是中枢神经系统中一种主要的抑制性神经递质(Christensen，H.N.(1994)J.Exp.Biol.196，297-305)。在植物体内，它广泛存在于植物及植物器官中，正常生长条件下植物GABA的含量为0.03-2.00μmol·g
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FW。在某些生物和非生物胁迫条件下，包括干旱，涝害，
温度胁迫，低氧，UV辐射，病虫害，机械损伤等都可以引起GABA在植物体内的迅速大量的积累(Satyanarayan，V.and Nair，P.M.，1990，Phytochemistry，29，367-375)。 在农业生产中，经常会遇到低温、高温等不良气温条件的影响。农作物对温度的反应存在最低温度、最适温度和最高温度三基点，过高或过低的温度胁迫都不利于作物的生长。植物遇到低温胁迫时，细胞膜透性增加膜内大量溶质外渗，原生质流动减慢或停止，光合速率减弱，呼吸速率大起大落，有机物分解占优势，最终导致组织柔软、萎蔫；而高温能直接导致蛋白质变性与凝固，伴随蒸腾加强与细胞脱水，叶片死斑明显，叶绿素破坏严重，器官脱落等。
我国主要农作物在不同的生育期都存在不同程度的温度逆境。我国小麦主要产区黄淮海地区受到热带季风的影响，小麦生长的后期日最高温常常在30℃以上，并伴随有干热风出现，可引起小麦30％以上的减产；南方早季水稻在育秧期遭遇低温、开花灌浆期遭遇连日高温，华北地区春季棉苗期低温等严重影响农作物的生产发育，进而引起产量降低甚至绝收。
针对温度逆境对农作物生产带来的不良影响，可以通过农业栽培措施来提高农作物忍耐高温、低温等温度胁迫带来的危害。一些植物生长物质可以用来提高植物对温度的抵抗能力，如20μg.L
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脱落酸可保护苹果苗不受冻害，细胞素对许多
作物，如玉米等有增强抗冻性的作用。发明内容
本发明的目的是提供γ-氨基丁酸的一种新用途。
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本发明所提供的γ-氨基丁酸的用途是γ-氨基丁酸在提高植物耐温度胁迫能力中的应用。
所述温度胁迫的温度因具体的植物而异，如对于冬小麦京都40来说，30℃以上是高温胁迫；对于小麦中优9507来说，29℃以上为高温胁迫；对于棉花中棉45来说，5℃以下是低温胁迫；对于水稻杂交籼稻特优559来说，42℃以上为高温胁迫；对于玉米郑单958来说，8℃以下为低温胁迫；对于大豆东农46来说，6℃以下是低温胁迫。
所述提高植物耐温度胁迫能力的方法为：用所述γ-氨基丁酸对植物进行处理，所述处理的方法为浸种和/或叶面喷施。
在上述应用中，为了使植物获得较好的耐温度胁迫能力，所述浸种的时期为种子萌发前，所述叶面喷施的时期为作物生长期。
所述γ-氨基丁酸的浓度具体可为0.01-10mM。γ-氨基丁酸处理浓度和处理方法可根据不同的作物种类和不同的生育时期进行调整，如：对小麦浸种时γ-氨基丁酸的浓度可为0.5mM，而在小麦灌浆期采用浓度为0.01mMγ-氨基丁酸对进行叶面喷施。
所述温度胁迫为高温胁迫和/或低温胁迫。
本发明中所述植物既可为单子叶植物，也可为双子叶植物；所述单子叶植物具体可为小麦、玉米和水稻，所述双子叶植物具体可为大豆和棉花。
试验证明，用γ-氨基丁酸(GABA)对小麦和水稻进行处理，提高了小麦和水稻耐高温胁迫的能力，减少高温带来的危害，减少了产量损失；用γ-氨基丁酸(GABA)对玉米、棉花和大豆进行处理，提高了玉米、棉花和大豆耐低温胁迫的能力，减少低温带来的危害，减少了产量损失。
本发明所提供的γ-氨基丁酸的另一个用途是γ-氨基丁酸在促进植物生长，和/或提高植物产量，和/或提高植物品质中的应用。
试验证明，用γ-氨基丁酸(GABA)对小麦进行处理，提高了小麦幼苗的株高、总根长和根表面积，促进了小麦幼苗的生长，同时还提高了小麦的产量和品质；用γ-氨基丁酸(GABA)对水稻进行处理，提高了水稻剑叶叶绿素含量和穗上部籽粒干重。
本发明提供了γ-氨基丁酸在提高植物耐温度胁迫能力中的应用，用γ-氨基丁酸提高植物耐温度胁迫能力，与现有的技术方法相比具有至少以下优势：(1)相对于植
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物生长调节剂来说，GABA均为生物体内天然存在的氨基酸，对人体不存在任何毒性，处理作物后不存在残毒残效；(2)相对于其它新的植物生长调节剂，GABA活性更高；(3)GABA作为植物内源保护性物质和逆境信号物质增强植物的抵抗逆境能力的机理明确，开发应用针对性强；(4)处理简便，可操作性强。 具体实施方式
下面具体实施例，仅对本发明作出详细说明，但不本发明。 实施例1、GABA浸种提高小麦幼苗的耐高温能力 1、实验方法
材料为小麦，品种为冬小麦京都40(国家农作物种质保存中心)。 将冬小麦京都40分别进行下述四种处理：
A、将小麦用清水浸种24小时后，用蛭石和沙土(体积比7：3)培养，控制温度：白天(14小时)25℃，晚上(10小时)20℃。一直在此温度培养，直至C和D处理同时取样。
B、将小麦用0.5mM的GABA水溶液浸种24小时后，用蛭石和沙土(体积比7：3)培养，控制温度：白天(14小时)25℃，晚上(10小时)20℃。一直在此温度培养，直至C和D处理同时取样。
C、将小麦用清水浸种24小时后，用蛭石和沙土(体积比7：3)培养，控制温度：白天(14小时)25℃，晚上(10小时)20℃。当小麦苗长到10厘米左右时，进行高温胁迫处理，白天(14小时)40℃，晚上(10小时)30℃。处理48小时后取样。
D、将小麦用0.5mM的GABA水溶液浸种24小时后，用蛭石和沙土(体积比7：3)培养，控制温度：白天(14小时)25℃，晚上(10小时)20℃。当小麦苗长到10厘米左右时，进行高温胁迫处理，白天(14小时)40℃，晚上(10小时)30℃。处理48小时后取样。
取样后，调查株高、总根长和根表面积，测定叶片相对含水量、相对电导率和丙二醛含量(结果见表1)。每个处理设置4个重复。
叶片相对含水量用烘干法测定。具体方法如下：叶片取样后快速用天平测量其鲜重，用烘箱100℃烘30分钟，然后用烘箱在80℃下烘干48小时，用天平测量其干重，相对含水量(％)＝(鲜重-干重)/干重×100％。
相对电导率用电导率仪法测定(Saadalla等，1990年，Crop Sci，30：1243-1247)。
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具体测定方法如下：把叶片从离叶尖2厘米处开始，剪成1厘米长的小段，每个处理取10段，用10毫升去离子水冲洗3次，放入刻度试管，用去离子水定容到10毫升，用真空泵抽真空2小时，用电导率仪(型号EC 215，美国Markson Science公司)测定溶液的电导率(C1)。把测定试管在沸腾水中煮1小时，用冷水冲洗快速冷却到25℃，再测定溶液的电导率(C2)。同时测定去离子水的电导率(Cw)。相对电导率(R，％)用如下公式计算：R＝(C1-Cw)/(C2-Cw)×100％。
丙二醛(MDA)含量采用下述方法进行测定：取叶片样品0.5克加入到5毫升浓度为50nmol/ml磷酸盐缓冲液(pH7.0)中，在冰浴上磨碎，4℃下12000g离心15分钟，取上清液2毫升(对照加2ml蒸馏水)，加入2毫升质量百分含量为0.6％的硫代巴比妥酸溶液，混匀物于沸水浴上反应15分钟，迅速冷却后再离心。取上清液分别测定532纳米、600纳米和450纳米波长下的消光度(D)。按下述公式计算丙二醛含量(M，微摩尔/克鲜重)：M＝[6.45×(D532—D600)—0.56D450]×5。 2、实验结果
由表1中的A和C处理可知，高温胁迫则抑制了小麦幼苗的生长。由A和B处理可知，正常生长条件下，GABA处理可促进了小麦幼苗的生长；由C和D处理可知，用GABA处理小麦种子能够缓解高温胁迫对幼苗生长的抑制作用，提高了株高、总根长和根表面积；高温胁迫使小麦叶片脱水，叶片含水量显著下降；GABA处理提高了高温胁迫下叶片的含水量，降低了小麦叶片的电导率和丙二醛含量，提高了小麦幼苗对高温胁迫的抵抗能力。
表1 GABA处理对高温胁迫下小麦幼苗生长和耐性的影响
实施例2、GABA处理对高温胁迫下小麦产量和品质的影响 1、实验方法
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材料为小麦，品种为中优9507(中国农业科学院作物研究所)，试验地点为中国农业大学海淀区上庄试验站，栽培管理按常规方法进行。 对中优9507分别进行下述四种处理： A、开花期用清水对叶面进行均匀喷雾处理。
B、开花期用浓度为0.01mM GABA的水溶液对叶面进行均匀喷雾处理。 C、开花期用清水对叶面进行均匀喷雾处理；小麦灌浆期(开花后10天-开花后23天)进行高温胁迫处理2周，温度为白天48℃(12小时)/夜间(12小时)29℃。
D、开花期用浓度为0.01mM GABA对叶面进行均匀喷雾处理；小麦灌浆期(开花后10天-开花后23天)进行高温胁迫处理2周，温度为白天48℃(12小时)/夜间(12小时)29℃。
收获时调查经过上述处理的小麦的千粒重、穗粒数，计算产量，进行粗蛋白含量、沉降值和干、湿面筋含量等品质分析(结果见表2)。粗蛋白含量按中国国家标准“粮食，油料检验-粗蛋白测定法(GB/T 5511-1985)”测定，沉降值按中国国家标准“小麦粉沉降值测定法(GB/T 15685-1995)”测定，干面筋含量按中国国家标准“小麦粉干面筋测定法(GB/T 14607-1993)”，湿面筋含量按中国国家标准“小麦粉湿面筋测定法(GB/T 14608-1993)”测定。 2、实验结果
由表2中的A和C处理可知，高温胁迫大幅降低了小麦的产量，降低了小麦的品质。由A和B处理可知，正常生长条件下，GABA处理可提高小麦的千粒重、穗粒数和产量并且提高了小麦的品质。由表2中的C和D处理可知，GABA处理显著提高了高温胁迫下小麦的千粒重、穗粒数和产量，说明GABA处理能缓解高温胁迫所造成的小麦减产，并提高小麦品质。
表2 GABA处理对高温胁迫下小麦产量和品质的影响
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实施例3、GABA提高棉花幼苗耐低温胁迫能力 1、实验方法
材料为棉花，品种为中棉45(中国农业科学院棉花研究所)，用清水浸种24小时，用花土和蛭石(体积比为7:3)在塑料盆中培养，每盆4株。试验在光照培养箱中进行，光照时间为14小时，昼(12小时)28℃，夜(12小时)24℃，光照强度400μmol.m.s，相对湿度66％。
出苗后10天，对中棉45分别进行下述三种处理，各处理的光照时间、强度和相对湿度同上：
A、对棉花叶面喷施清水，3天后在20℃处理，处理3天后取样。
B、对棉花叶面喷施清水，3天后进行5℃低温处理，处理3天后取样。 C、对棉花叶面喷施5mM GABA水溶液，3天后进行5℃低温处理，处理3天后取样。
取经过上述3种处理的真叶测定SOD(超氧化物歧化酶)、POD(过氧化物酶)、CAT(过氧化氢酶)、活性以及可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸含量(结果分别见表3和表4)，每个处理设置3个重复。
SOD、POD、CAT活性、可溶性蛋白、可溶性糖含量(蒽酮比色法)、脯氨酸含量(酸性茚三酮比色法)测定方法和具体操作见邹琦等主编的植物生理学实验指导(中国农业出版社，2000年)。 2、实验结果
由表3可知，低温胁迫提高了棉花叶片中SOD、POD、CAT的活性，GABA处理后又进一步提高了增加的幅度，达到差异显著水平(试验数据用SAS数据软件进行处理，以邓肯新复极差测验不同处理间的差异显著性(P<0.05))，GABA通过对保护酶活性的调节来提高棉花幼苗对低温胁迫的适应能力。同时，GABA处理提
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高了棉花叶片可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸的含量，增强了幼苗对低温胁迫的抵抗能力。
表3 GABA处理对低温胁迫棉花幼苗的影响
表4 GABA处理对低温胁迫棉花幼苗的影响
实施例4、GABA处理对高温胁迫下水稻生长的影响 1、实验方法
材料为水稻，品种为杂交籼稻特优559(江苏省沿海地区农科所)，试验地点为中国农业大学海淀区上庄试验站，栽培管理按常规进行。用塑料桶进行种植，每桶3株，栽培管理按常规进行。
抽穗后7天，对水稻分别进行下述四种处理：
A、用清水对叶面进行均匀喷雾处理，自然环境下常温进行照射，直至与C、D处理同时取样。
B、用浓度为0.01mM GABA水溶液对叶面进行均匀喷雾处理，自然环境下常温进行照射，直至与C、D处理同时取样。
C、用清水对叶面进行均匀喷雾处理，处理后5天(抽穗后12天)开始用智能人工气候箱内进行高温处理，每天处理6小时(9:00-15:00)，持续10天，温度为
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42℃±0.5℃，高温胁迫开始后第14天取样。
D、用浓度为0.01mM GABA水溶液对叶面进行均匀喷雾处理，处理后5天(抽穗后12天)开始用智能人工气候箱内进行高温处理，每天处理6小时(9:00-15:00)，持续10天，温度为42℃±0.5℃，高温胁迫开始后第14天取样。
测定剑叶叶绿素含量，取穗上部籽粒烘干后测定籽粒干重，重复4次(结果见表5)。叶绿素含量用叶绿素仪SPAD-502(日本MINOLTA公司生产)测定。 2、实验结果
由表5中的A和C处理可知，高温胁迫降低了水稻剑叶叶绿素含量和穗上部籽粒干重。由C和D处理可知，GABA处理显著提高了高温胁迫下水稻的剑叶叶绿素含量和穗上部籽粒干重。结果表明GABA处理能够缓解由于高温胁迫对水稻产生的危害，减少产量损失。
表5 GABA提高高温胁迫下水稻剑叶叶绿素含量和穗上部籽粒干重
实施例5、GABA处理对低温胁迫下玉米种子萌发的影响 1、实验方法
材料为玉米，品种为郑单958(北京德农种业有限公司)。种子用0.1％(质量百分含量)次氯酸钠溶液杀菌30分钟，用浓度为0.1mM GABA浸种24小时，清水作对照。浸种后用垂直板发芽法进行幼苗培养，每个重复处理25粒种子。先放入8℃低温培养箱中培养7天，然后转入25℃常温培养室进行发芽。实验结束后按常规方法计算发芽势、发芽率、发芽指数。试验重复4次。
发芽势是指种子发芽初期它在规定时间内能正常发芽的种子粒数占供检种子粒数的百分率，是判断田间出苗率的指标；发芽率是指种子发芽终止在规定时间内的全部正常发芽种子粒数占供检种子粒数的百分率，是用以判断田间出苗率；发芽指数＝∑(Gt/Dt)，式中，Gt代表在第t天种子的发芽数，Dt代表相应的发芽天数。
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2、实验结果
GABA处理提高了低温胁迫下玉米种子的发芽势、发芽率和发芽指数，促进了玉米种子的萌发。
表6 GABA处理对低温胁迫玉米种子萌发的影响
实施例6、GABA处理对低温胁迫下大豆种子萌发的影响 1、实验方法
材料为大豆，品种为东农46(东北农业大学大豆研究所)。种子用0.1％(质量百分含量)次氯酸钠溶液杀菌30分钟，均匀摆放在培养皿双层滤纸上，每培养皿50粒种子。
对大豆种子分别进行下述四种处理：
A、将种子置于20℃进行萌发，同时加入清水对种子进行处理。
B、将种子置于6℃低温下进行萌发，同时加入清水对种子进行处理。 C、将种子置于6℃低温下进行萌发，同时加入0.1mM GABA的水溶液对种子进行处理。
在处理后6小时测定SOD活性，处理后12小时测定POD活性，处理后18小时测定CAT活性。试验重复4次。SOD、POD、CAT活性、可溶性蛋白、可溶性糖含量(蒽酮比色法)、脯氨酸含量(酸性茚三酮比色法)测定方法和具体操作见邹琦等主编的植物生理学实验指导(中国农业出版社，2000年)。 2、实验结果
由表7可知，低温胁迫提高了大豆种子中SOD和POD的活性，降低了CAT活性；GABA处理后进一步提高了低温胁迫下大豆种子中SOD和POD的活性，提高了CAT活性。结果表明，GABA通过对保护酶活性的调节来提高大豆种子对低温胁迫的抵抗能力。
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表7 GABA处理对低温胁迫大豆种子萌发的影响
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