广西大学环境工程基础实验报告
湖塘水体叶绿素a测定
姓 名： 学 号： 班 级： 组 别： 指导教师：
实验概述
【实验目的及要求】
（1）初步了解叶绿素a测定的原理和常规测定方法。
（2）通过实验，掌握叶绿素a的测定方法及富营养化水样的前处理方法。 （3）熟练掌握抽滤装置及分光光度计的使用。
【实验原理】
浮游植物的主要光合色素是叶绿素(Chlorophyll)，常见的有叶绿素a、b和c.叶绿素a（chl-a）存在于所有的浮游植物中，大约占有机物干重的1-2%，是估算浮游植物生物量的重要指标，因此浮游植物叶绿素a含量的测定成为浮游植物生物量的重要指标而被广泛应用。
浮游植物叶绿素a的测定方法有许多种，根据所使用的仪器可以分为高效液相色谱法（HPLC法）、荧光光度计法和分光光度计法等。高效液相色谱法能够很精确地测定各种光合色素的含量，但由于仪器昂贵，分析操作步骤繁琐，一般不能用于野外大量样品的快速分析。荧光光度计也能够精确地测定叶绿素a的含量，特别是能够测定叶绿素a含量较低的样品，但由于分析过程中容易受其他色素或色素衍生物的干扰，也不利于快速分析各类不同的野外样品。因此，分光光度计法成为最常用的浮游植物叶绿素a含量的测定方法。
在所有分光光度计法中，根据所用的色素萃取液分为了丙酮法、甲醇法和乙醇等，再根据比色所用的波长，又分为单色法和多色法（例如单色丙酮法和四色丙酮法）等。主要的细胞破碎法有研磨、低温冻融、超声破碎等。尽管丙酮现在仍广泛用于实际分析中，但由于丙酮的萃取效率比较差，特别是对蓝藻的叶绿素a的萃取效率比较低，使得甲醇和乙醇成为替代丙酮的色素萃取剂。不过，甲醇对人体毒害性大，且在酸化过程中容易产生误差，于是，乙醇成为现在广泛应用的叶绿素a的萃取剂。超声破碎法因快速、提取效率高等特点也被研究者所青睐。
本实验介绍一种以热乙醇为萃取溶剂，结合超声细胞破碎法为基础的叶绿素a含量测定方法。
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叶绿素a和少数处于特殊状态的叶绿素a的关系：叶绿体内类囊体薄膜上的色素，可以分为两类：一类具有吸收和传递光能的作用，包括绝大多数的叶绿素a，以及全部的叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素；另一类是少数处于特殊状态的叶绿素a，这种叶绿素a不仅能够吸收光能，还能使光能转换成电能。在光的照射下，具有吸收和传递光能作用的色素，将吸收的光能传递给少数处于特殊状态的叶绿素a，使这些叶绿素a被激发而失去电子(e)。脱离叶绿素a的电子，经过一系列的传递，最后传递给一种带正电荷的有机物——NADP+(中文简称是辅酶Ⅱ)。失去电子的叶绿素a变成一种强氧化剂，能够从水分子中夺取电子，使水分子氧化生成氧分子和氢离子(H+)，叶绿素a由于获得电子而恢复稳态。这样，在光的照射下，少数处于特殊状态的叶绿素a，连续不断地丢失电子和获得电子，从而形成电子流，使光能转换成电能。
实验内容
【实验方案设计】
（1） 稀释实验室培养的铜绿微囊藻得到水样
（2） 取两组水样各100ml，进行抽滤，抽滤完用滤纸吸去水分后冷冻12h （3） 利用热乙醇-超声法进行Chl-a的提取
（4） 根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计测定（最
大吸收波长下的吸光值，进行浊度校正）
（5） 利用公式计算叶绿素a的含量
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【实验过程】（实验步骤、记录、数据、分析 ） 取稀释过的水样 两组，各100ml 用醋酸纤维滤膜在0.5个大气压抽滤 放入离心机，转速 4000r/min，离心10min 加10ml热乙醇，75℃恒温5min，超声清洗机破碎30min 取下滤膜，对折，用普通滤纸吸去水分，置于表面皿中冷冻12小时 取出滤膜，剪碎，置于具塞离心管 用90%乙醇对分光光度计调零，记录水样在750nm 与665nm的吸光度 加入2滴1mol/L盐酸酸化，记录750nm与665nm的吸光度 实验结束，整理仪器。
数据记录： 1号管 1号管（加酸） 2号管 2号管（加酸）
数据处理：
1号试管：校正后665nm的吸光度 0.08-0.007=0.073
校正（加酸）后665nm的吸光度 0.061-0.006=0.055 叶绿素a=(29.62*（0.073-0.055）*10)/(0.1*1)=53.316mg/m3
2号试管：校正后665nm的吸光度 0.157-0.018=0.139 校正（加酸）后665nm的吸光度 0.102-0.016=0.086
叶绿素a=(29.62*（0.139-0.086）*10)/(0.1*1)=159.986mg/m3
数据分析： 2号管数据远大于1号管数据，原因可能是因为两次过滤用的滤
665nm 0.08 0.061 0.157 0.102 750nm 0.007 0.006 0.018 0.016 叶绿素a(mg/m3) 47.916 156.986
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膜的孔径不一样。1号管采用的滤膜孔径比较大，导致叶绿素通过滤膜小孔流失，使测量的时候叶绿素含量很低。2号管采用的滤膜孔径比较小，叶绿素流失较少，实验测得叶绿素也比较多。 【结论】
由表中数据可知，2号样品测得的叶绿素a含量较合理，为156.986 mg/m3说明样品水已达到富营养化程度，水质已被严重污染，严重富营养化。根据数据可知，1号样品水质也是被污染，有中度富营养化。
【思考题】
（1） 查阅资料，根据所得的叶绿素a的含量，判断所测水样的富营养化程度，
并说明依据。
答：水体富营养化一般采用的指标是: 氮含量超 过0.2～ 0.3 mg/L , 磷含量大于0.01～ 0.02 mg/L ,BOD 大于10 mg/L , pH 值7～ 9 的淡 水中细菌总数超过10 万个/毫升, 叶绿素a 含量大于10 ug/L 。由实验数据可知，水样的叶绿素a含量分别为53.316mg/m3和156.986mg/m3，经判断1号水体为中度营养化，2号则为严重富营养状态。
（2）试对热乙醇-超声法的优缺点加以分析。
答：优点——1.超声波具有强大的机械传质作用以及空化作用等系列效应，使得细胞快速破碎，有利于溶剂浸入细胞而可以提高目标成分的提取率。 2.超声辅助热乙醇提取法效率高，误差小，而且对人体健康的影响远远小于丙酮。 3.有较高的精密度，操作简便快捷，重复效率高，减少了叶绿素a在提取分析过程中的损失，萃取效率高，误差小，而且乙醇对人体的健康影响小，较安全。
缺点——1、水浴温度、萃取时间把握的不够准确，过高或过低的温度、萃取时间的长短都会影响释放的叶绿素a的含量进而影响测定结果。
2、超声时间的长短也也会对叶绿素a的量造成影响，时间过短叶绿素a没有充分溶出，时间过长叶绿素a会被破坏。
3、乙醇具有易挥发的特点，在实验过程中其浓度会改变而影响叶绿素a的提取。 （3）本实验还有哪些地方需要改进，请给出你的建议。
答：由于光照等因素，测定叶绿素a时，样品应该尽快测定，并尽可能在低温和弱光条件下进行，以免因放置时间过长，叶绿素降解。为了使色素得到充分提取，提取时要把握提取时间，这样才能保证较高的提取效率，但不应太过延
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长提取时间，以免色素分解。
【实验体会】
本次实验增加了对许多仪器的认识以及操作，抽滤装置、超声清洗机、离心机以及分光光度计等，尤其是分光光度计的使用更加熟练。基于课本上的认识后对于这些仪器有了更直观的认识，不在是只存于想象中，也不在是那么的神秘，原来操作也是很简单易学的。
指导教师评语及成绩：
成绩： 指导教师签名
批阅日期
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