第２２卷第４期 淮海工学院学报（自然科学版） Ｖｏ１．２２ ＮＯ．４ ２０１３年１２月 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕａｉｈａｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｆｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ） Ｄｅｃ． ２Ｏ１３ ＤＯＩ：１０．３９６９／Ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２—６６８５．２０１３．０４．０１５ 注射用药用辅料甘露醇细菌内毒素检查方法研究 刘惠萍 （正大天晴药业集团股份有限公司，江苏连云港２２２０００） 摘 要：为了建立注射用药用辅料甘露醇的细菌内毒素检查方法，根据《中华人民共和国药典二部 （２０１０年版）》中的“细菌内毒素检查法及指导原则”进行试验。将甘露醇溶解稀释至１００ ｍｇ・ ｍＬ－。，用标示灵敏度 为０．１２５ ＥＵ・ｍＬ 的鲎试剂检测其细菌内毒素。结果表明，１００ ｍｇ・ ｍＬ 的甘露醇及稀释液对细菌内毒素检查无干扰。说明鲎试剂方法用于甘露醇的细茵内毒素检 查是可行、有效的。 关键词：注射用药用辅料；甘露醇；细茵内毒素；鲎试剂 中图分类号：Ｒ９２７ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７２－６６８５（２０１３）０４－００５９－０４ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ Ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｎｊ ｅｃｔａｂｌｅ Ａｕｘｉｌｉａｒｙ Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｍａｎｎｉｔｏｌ ＬＩＵ Ｈ ｕｉ—ｐｉｎｇ （Ｃｈｉａ－ｔａｉ Ｔｉａｎｑｉｎｇ ＰｈａｒｍａＬｅｕｔｉｃａｌ Ｇｒｏｕｐ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｌｉａｎｙｕｎｇａｎｇ ２２２０００，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｊ ｅｃｔａｂｌｅ ａｕｘｉｌ— ｉａｒｙ ｍａｔｅｒｉａｌ ｍａｎｎｉｔｏｌ，ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｗａｓ ｉｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ ｔｅｓｔ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｇｕｉｄｉｎｇ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ ２０１ ０ ｅｄｉｔｉｏｎ Ｖｏ！．ＩＩ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ ｉｎ ｍａｎｎｉｔｏ１ ｔｈａｔ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ａｎｄ ｄｉｌｕｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ １００ ｍｇ・ｍＬ ｗａｓ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ ａｍｅｂｏｃｙｔｅ ｌｙｓａｔｅ ｗｉｔｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ０．１２５ ＥＵ・ｍＬ～．Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １００ ｍｇ・ｍＬ一 ｍａｎｎｉｔｏｌ ａｎｄ ｉｔｓ ｄｉｌｕｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｄｏ ｎｏｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ ｔｅｓｔ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａ１ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ ｔｅｓｔ ｉＳ ｆｅａｓｉｂｌｅ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｂａｃｔｅｒｉａ１ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ ｉｎ ｍａｎｎｉｔｏ１． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｉｎｊ ｅｃｔａｂｌｅ ａｕｘｉｌｉａｒｙ ｍａｔｅｒｉａｌ；ｍａｎｎｉｔｏｌ；ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ；ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ ａｍｅｂｏｃｙｔｅ ｌｙｓａｔｅ 料的热原或细菌内毒素等应符合要求” ］。建立注 ０ 引言 射剂药用辅料标准中的细菌内毒素或热原检查项对 临床用药安全具有重要的意义。 甘露醇在医药上是良好的利尿剂，对于降低颅 本文参照《中华人民共和国药典二部（２０１０年 内压、眼内压也有很好的疗效，也用作药品的赋形剂 版）》中有关细菌内毒素的检查方法口 以及其他的相 及填充剂，是常用的注射用药用辅料。《中华人民共 关文献ｌ＿２。 进行试验，建立了甘露醇的细菌内毒素检 和国药典二部（２０１０年版）》中规定，“注射用药用辅 查方法。 收稿日期：２０１ ３－１０－３０；修订日期：２Ｏ１３－１１ ２２ 作者简介：刘惠萍（１ ９７８一），女，江苏连云港人，正大天晴药业集团股份有限公司ｌｌＪ：程帅，主要从事药品质量方面的研究，（Ｅ—ｍａｉｌ） ｕｈｕｉｐｉｎｇ７８＠１６３．ＣＯｎｌ。 ６Ｏ 淮海工学院学报（自然科学版） ２０１ ３年１ ２月 ｉｎｔｅｎｄｅｄ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ ｏｆ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ １ 材料及用具 １．１ 仪器 ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ａ ｆｕｒｔｈｅｒ ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ ｐｒｏｅｅ— ｄｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ：一ｌｅｓｓ ｔｈａｎ ４ ＩＵ／ｇ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｈａｖｉｎｇ ａ ＥＴ－９６内毒素凝胶法测定仪（天津天大天发科技 有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（上海森信实验仪器 有限公司）；漩涡混合器（ＺＨ＿２，天津药典标准仪器厂）。 １．２实验材料 ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ １ ００ ｇ／Ｌ ｏｒ ｌｅｓｓ ｏｆ ｍａｎｎｉｔｏｌ；一ｌｅｓｓ ｔｈａｎ ２．５ ＩＵ／ｇ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｈａｖｉｎｇ ａ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ １００ ｇ／Ｌ ｏｆ ｍａｎｎｉ－ ｔｏｌ”＿２］。《美国药典》中规定“Ｉｔ ｃｏｎｔａｉｎｓ ｎｏｔ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ０．０４ ＵＳＰ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｕｎｉｔ ｐｅｒ ｍｇ ｏｆ ｍａｎｎｉｔｏｌ 甘露醇（河北华旭药业有限责任公司，批号 １１１００３３，１１１００３６，１１１００３７）；细菌内毒素工作标准品 （ＣＡＳＥ，中国食品药品检定研究院，批号１５０６０１－ ２０１１７４，规格为１６０ ＥＵ／支）；细菌内毒素检查用水 ｗｈｅｒｅ ｔｈｅ ｌａｂｅｌｅｄ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｍａｎｎｉｔｏｌ ｉｎ ｔｈｅ Ｉｎｊｅｃ— ｔｉｏｎ ｉｓ １０ ｏｒ ｌｅｓｓ，ａｎｄ ｎｏｔ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ２．５ ＵＳＰ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｕｎｉｔｓ ｐｅｒ ｇ ｏｆ ｍａｎｎｉｔｏｌ ｗｈｅｒｅ ｔｈｅ ｌａ— （ＢＥＴ水，批号１１０８０９０，规格为５ Ｌ／支，湛江博康海 洋生物有限公司）；鲎试剂（ＴＡＬ，批号１１０４０１２，标示 灵敏度为０．１２５ ＥＵ・ｍＬ＿。，规格为０．１ ｍＬ／支，湛江 安度斯生物有限公司）；鲎试剂（ＴＡＬ，批号１１０５２００， ｂｅｌｅｄ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｍａｎｎｉｔｏｌ ｉｎ ｔｈｅ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｉｓ ｇｒｅａｔｅｒ ｔｈａｎ １０ ”［３］。《中华人民共和国药典二部（２０１０年 版）》中，该品种并未收载细菌内毒素检查项，但其质 量分数为２Ｏ 的甘露醇注射液项中规定“取本品， 标示灵敏度为０．１２５ ＥＵ・ｍＬ＿。，规格为０．１ ｍＬ／支， 湛江博康海洋生物有限公司）。 １．３实验用具 依法检查（附录ⅪＥ），每１ ｇ甘露醇中含内毒素的量 应小于１．２５ ＥＵ”。 考虑到甘露醇作为注射剂的药用辅料，不同制 剂所用的量也不同，为从严要求，参照《中华人民共 试管、试管架、安瓿架、三角瓶、金属制密封器、 剪刀、砂轮、体积分数为７５ 的酒精棉球、封口膜、 可调式移液器及无热原配套头等。所用玻璃器皿 需经２５０。Ｃ干烤３Ｏ ｒａｉｎ以上。 和国药典二部（２０１０年版）》，将其细菌内毒素限值 拟定为Ｌ＝＝：１．２５ ＥＵ／ｇ。 ２．２鲎试剂灵敏度的复核ｎ］ 按照《中华人民共和国药典二部（２０１０年版）》 ２方法与结果 ２．１细菌内毒素限值的确定 细菌内毒素检查法规定，进行鲎试剂的标示灵敏度 复核试验，试验结果见表１。结果显示，２批鲎试剂 灵敏度测定值（．＝【。）均在０．５ ～２．０ 之间（包括０．５；ｔ 《欧洲药典》中，细菌内毒素检查项中规定“Ｉｆ 和２．ｏａ），符合规定。 表１鲎试剂灵敏度复核结果 Ｔａｂｌｅ １ Ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｏｆ ｔｈｅ ｌａｂｅｌｅｄ ｌｙｓａｔｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ 注：“＋”表示反应呈阳性，“一”表示反应呈阴性。 ２．３干扰试验 ４００，２００，１００，５Ｏ，２５ ｍｇ・ｍＩ『 ，将质量浓度为 ２．３．１ 干扰试验预试验 甘露醇的最小有效稀释 浓度（ＭＶＣ）按下式 计算： ＭＶＣ＝Ａ／Ｌ。 ４００，２００，１００，５Ｏ，２５ ｍｇ・ｍＬ 系列溶液记为供试 品阴性对照（ＮＰＣ）；同时在质量浓度为８ＯＯ，４００， ２００，１００，５０ ｍｇ・ｍ 溶液中加入等体积４ 浓度 的内毒素溶液，并将其作为供试品阳性对照（ＰＰＣ）。 另取２支加入ＢＥＴ水作为阴性对照，２支加入２ 考虑到现市售鲎试剂分别为０．５，０．２５，０．１ ２５， ０．０６，０．０３ ＥＵ・ｍ１ 共５个灵敏度，将３批甘露醇 用ＢＥＴ水进行稀释，使其终质量浓度分别为８００， 浓度的内毒素标准溶液作为阳性对照。放入内毒素 第４期 刘惠萍：注射用药用辅料甘露醇细菌内毒素检查方法研究 ６１ 凝胶法测定仪中，３７℃保温６Ｏ ｍｉｎ。试验测定结果 如表２所示。 表２甘露醇干扰预试验测定结果 Ｔａｂｌｅ ２ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｍａｎｎｉｔｏｌ 注：“十”表不阳性，“一”表不阴性。 当阴性对照为阴性，阳性对照为阳性时，实验为 ２．３．２ 干扰试验根据预试验结果并结合实际，用 有效。当系列浓度中出现供试品溶液２管为阴性， ０．１２５ ＥＵ・ｍＬ－１的鲎试剂进行干扰试验。 供试品阳性对照２管为阳性时，认为供试品在该浓 将甘露醇用细菌内毒素检查用水稀释至终质量 度下不干扰试验，此质量浓度即为最大不干扰质量 浓度为１００ ｍｇ・ｍＬⅢ１的溶液（供试品阴性对照 浓度。即可选择该质量浓度进行正式干扰试验。由 液）。分别用ｉ００ ｍｇ・ｍＬ 的供试品稀释液及 表２结果可见，高质量浓度供试品溶液抑制鲎试剂 ＢＥＴ水稀释ＣＳＥ，配制成细菌内毒素最终浓度分别 与细菌内毒素的凝胶反应［９］，将供试品溶液稀释至 为０．２５，０．１２５，０．０６，０．０３ ＥＵ・ｍＬ 的系列溶液。 １００ ｍｇ・ｍＬ 后，此抑制作用消除。即可选择该质 按照药典中的凝胶法进行干扰试验。测定结果如表 量浓度进行正式干扰试验。 ３所示。 表３甘露醇凝胶法干扰试验测定结果 Ｔａｂｌｅ ３ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｆｅｎｃｅ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｍａｎｎｉｔｏｌ 注：“＋”表示阳性，“一”表示阴性，“＊”表示表格空白。 结果表明，２批鲎试剂的Ｅ 均为０．１２５ ＥＵ・ １００ ｍｇ・ｍ 的甘露醇溶液在此试验条件下对细 ｍＬ ～，在０．５ ～２．０Ａ之间，而对应３批供试品的Ｅ 菌内毒素检查无干扰，可使用细菌内毒素检查法。 值不论是０．１０４ ＥＵ・ｍｌ 还是０．０８７ ＥＵ・ ２．４常规检验 ｍＩ ，都在０．５Ｅ ～２．０Ｅ 之间，故认为质量浓度为 将３批供试品分别用ＢＥＴ水溶解稀释至质量 ６２ 淮海工学院学报（自然科学版） ２０１３年１２月 浓度为１００ ｍｇ・ｍＬ～ ，用上述两个厂家的鲎试剂， 细菌内毒素检查法规定，进行检验。结果３批供试 按照《中华人民共和国药典二部（２０１０年版）》附录 品的细菌内毒素检查均符合规定，结果见表４。 表４细菌内毒素检查结果 Ｔａｂｌｅ ４ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｍａｎｎｉｔｏｌ 注：“＋”表示阳性，“一 表示阴性 ３ 讨论 ［４３ 中国药品生物制品检定所．中国药品检验标准操作规 范（２０１０版）［Ｍ］．北京：中国医药科技出版社，２０１０： ３１０－３２０． 以上试验结果表明，高质量浓度的甘露醇溶液 对本品的细菌内毒素检查有干扰，存在抑制作用，通 ［５］蔡彤，张国来，李波，等．８４种注射用药品细菌内毒素 检查法的方法学研究［Ｊ］．中国药学杂志，２０１０，４５（２）： 过将供试品溶液稀释至１００ ｍｇ・ｍＬ＿。，可排除干 １５Ｏ一１５５． 扰作用，即可用鲎试剂方法检查本品的细菌内毒素。 Ｅ６］彭娟，栾春芳，普少平．卡铂原料药细菌内毒素检查方 因此本品的细菌内毒素检查法是可行的，其限值为 法的研究［Ｊ］．贵金属杂志，２００９，３０（２）：４６—５０． 每１ ｍｇ甘露醇中含内毒素的量应小于１．２５ ＥＵ／ｇ。 ［７］金艳，王益民．西眯替丁原料药细菌内毒素检查方法的 研究［Ｊ］．中国药学杂志，２０１２，２１（８）：４６—４． 参考文献： ［８］李展，周继春．注射用盐酸川穹嗪细菌内毒紊检查法的 ［１］国家药典委员会．中华人民共和国药典二部（２０１０年 研究［Ｊ］．中国药事杂志，２０１３，２７（８）：８８４—８８６． 版）［Ｍ］．北京：化学工业出版社，２０１０：附录１９—２Ｏ，９９— ［９］张辉．注射用头孢噻吩呐细菌内毒素检查法的研究 １０２． ［Ｊ］．广东药学院学报，２００５，２１（５）：５３７—５４２． ［２］Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｆ Ｅｕｒｏｐｅ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ（Ｓｅｖｅｎｔｈ －［１０］杜秋江．紫外分光光度法测定原料药中阿帕替尼的含 Ｅｄｉｔｉｏｎ）［ｓ］．６７０７５ Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ Ｃｅｄｅｘ，Ｆｒａｎｃｅ，２０１０： 量［Ｊ］．淮海工学院学报：自然科学版，２０１３，２２（１）： ２４３１． ３８—４Ｏ． ［３］Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ．Ｕｎｉｔｅｄ ［１１］姚忠，蒋锋．反相高效液相色谱法测定吉非罗齐片中 Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ（Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ ｄ ２０１１）［ｓ］．Ｕｎｉｔｅｄ 主药的含量［Ｊ］．淮海工学院学报：自然科学版，２０１２， Ｂｏｏｋ Ｐｒｅｓｓ，ｌｎｃ．，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２０１２：３７６６． ２１（４）：６３－６５． （责任编辑：褚金红）
