蛙类离体心脏灌流
一、【目的要求】
1、学习离体蛙心灌流法。
2、观察Na,K,Ca及肾上腺素(Adr),乙酰胆碱(ACh),乳酸对离体心脏活动的影响。 二、【原理】
将离体蛙心（失去神经支配的蛙心）保持在适宜的环境中，在一定的时间内仍然能够保持节律性收缩，心脏正常的节律性活动需要一个适宜的理化环境，离体心脏也是如此，离体心脏脱离了机体的神经支配和全身体液因素的直接影响，可以通过改变灌流液的某些成分，观察其对心脏活动的作用。心肌细胞的自律性、兴奋性、传导性及收缩性，都与钠、钾及钙等离子有关。外源性给予去甲肾上腺素或乙酰胆碱可产生类似心交感神经或迷走神经兴奋时对心脏的作用。 三、【实验仪器】
青蛙、 常用手术器械、蛙板(或蜡盘)、蛙心夹、计算机采集系统、张力传感器、支架、双凹夹、双针形露丝刺激电极、滴管、培养皿(或小烧杯)、棉线、任氏液。套管夹、0．65％NaCl、2％CaCl2、1％KCl、1：10000肾上腺素、1：10000乙酰肌碱、3%乳酸。
四、【方法与步骤】
1、斯氏蛙心插管法
（1）一只青蛙，双毁髓后背位置于蜡盘中，按前面的方法暴露心脏。仔细识别心脏周围的大血管(见右图)。在左主动脉下方穿一线，于动脉圆锥处结扎(动物个体小时，结扎位置可靠上些)。再从左右两主动脉下方穿一线，并打一活结备用。左手提起主动脉上的结扎线，右手用眼科剪在结扎线下方、沿向心方向将动脉上壁剪一斜口。选择大小适宜的蛙心套管，然后将盛有少量(套管内2～3 cm高度)任氏液(内加入一滴肝素溶液)的斯氏蛙心套管，山开口处插入动脉圆锥(见右图)。当套管尖端到达动脉圆锥基部时，应将套管稍稍后退，使尖端向动脉圆锥的背部后下方及心尖方向推进，经主动脉瓣插入心室腔内(于心室收缩时插入，但不可插得过深，以免心室壁堵住套管下口)。此时可见套管中血液冲人套管，并使液面随心脏搏动而亡下移动，表明操作成功(否则需退回并重新插入)。用滴管吸去套管中的血液，更换新鲜任氏液。稳定住套管后，轻轻提起备用线，将左、右主动脉连同插入的套管用双结扎紧(不得漏液)，再将结线固定在套管的小玻璃钩上，然后剪断结扎线上方的血管。轻轻提起套管和心脏，看清静脉窦的位置，于静脉窦下方剪断有牵连的组织，仅保留静脉窦与心脏的联系，使心脏离体(切勿损伤静脉窦)。用任氏液反复冲洗心室内余血，使套管内灌流液不再有残留血液。保持套管内液面高度一致～2 cm)，即可进行实验。 （2）将插好离体心脏的套管固定在支架上，用蛙心夹夹住少许心尖部肌肉 (不可夹得过多，以免因夹破心室而漏液)。再将蛙心夹上的系线绕过一个滑轮与张力传感器相连（如右图）。注意：勿使灌流液滴到传感器上。调节显示器上心脏收缩曲线的幅度适中。 2、 实验观察
(1)记录正常心搏曲线
(2)改用0．65％NaCI溶液灌流，并作好加药标记，观察心搏变化。待曲线 氏插管装置出现明显变化时，立即吸去套管中的灌流液，同时做好冲洗标记，并用新鲜任氏液清洗2—3次，待心搏恢复正常。注意：换液时切勿碰套管，以免影响描记曲线的基线，同时保持灌流液面一致(以下同)。
+
+
2+
观察可得，NaCI溶液会阻遏心脏搏动。
(3) 迅速用新鲜任氏液清洗2～3次，待心搏恢复正常。向套管内加入1～3滴2％CaCI：溶液，观察并记录心搏曲线的变化。当出现明显变化时，立即更换任氏液，待心搏恢复正常(如果恢复迟缓，可多次冲洗)。
(4)同法向套管中加1—2滴1％KCl溶液，记录心搏曲线的变化。当心搏曲线变化时，同法更换灌流液，待心搏恢复正常。
(5)同法记录套管中加入l～2滴的肾上腺素溶液(1：10 000)后心搏曲线的变化。 (6)同法记录套管中加入1—2滴乙酰胆碱溶液(1：10 000)后心搏曲线的变化。 （7）同法记录套管中加入l～2滴的3%乳酸后心搏曲线的变化。 五、【实验结果与原因分析】 曲线的幅度————收缩的程度 曲线的密度————心率
曲线的基线————舒张的程度 1、正常收缩曲线图
2、滴加%NaCl溶液图
分析：滴加%NaCl溶液后，心跳减弱，这是由于用%NaCl溶液灌注蛙心时，由于灌注液中缺乏Ca2+（），以致心肌细胞动作电位2期内流Ca2+减少，细胞质Ca2+浓度减少，心肌的收缩活动也随之减弱。 3、 滴加2%CaCl溶液
2＋＋2＋
分析：细胞外Ca在细胞膜上对Na内流有竞争性抑制作用，称为膜屏障作用。[Ca]
＋2
0增高时，Na内流受抑制，细胞0期除极速度与幅度减小，使兴奋性及传导性均降低。[Ca＋2＋
] 0增高使Ca内流增多，因此慢反应细胞0期去极化加快加强，传导性增高，而快反应细
2＋2＋
胞平台期缩短，有效不应期缩短，复极加速。Ca内流增多，使心肌收缩能力增强。[Ca]
所引起的变化与高钙时相反。因此加入CaCl2后，心率减少、振幅减少，基线上移。 0降低时，
4、 滴加1%KCl溶液
分析：滴加1％KCl后的心搏曲线发现，曲线的频率逐渐减小，愈来愈疏，幅度逐渐下降，最后停止在基线处，即心脏停博于舒张状态。因为当细胞K+浓度增高时，K+与Ca2+有竞争性拮抗作用，K+抑制细胞膜对Ca2+的转运，使进入细胞内Ca2+减少，心肌的兴奋—收缩偶联过程减弱，心肌收缩力降低。所以心搏曲线振幅减小。 5、 滴加1：10000肾上腺素溶液
分析：滴加肾上腺素后，蛙心收缩增强，心脏舒张完全，描记的心搏曲线幅度明显增大。其作用机理是，肾上腺素可与心肌细胞膜上的B受体结合，提高心肌细胞和肌浆网膜Ca2+通透性，导致肌浆中Ca2+浓度增高，使心肌收缩增强。另外，肾上腺素还有降低肌钙蛋白与Ca2+亲和力，促使肌钙蛋白对Ca2+的释放速率增加，提高肌浆网膜摄取Ca2+的速度，刺激Na+与Ca2+交换，使复极期向细胞外排出Ca2+的作用加速，这样，将使心肌舒张速度增快，整个舒张过程明显增强。
6、 滴加1：10000乙酰胆碱溶液
分析：上图可示，蛙心收缩减弱，心率减慢，最后出现蛙心停止舒张阶段。其机理为：乙酰胆碱与心肌细胞膜M受体结合，一方面提高心肌细胞膜K+通道的通透性，促使K+外流，将引起：1）窦房强细胞复极时K+外流增多，最大复极电位绝对值增大；Ik衰减过程减弱，自动除极速度减慢。这两方面因素导致窦房自律性降低，心率减慢。2）复极过程中K+外流增加，动作电位2、3期缩短，Ca2+进入细胞内减少，使心肌收缩减弱；另一方面乙酰胆碱可直接抑制Ca2+通道，减少Ca2+内流，进而使心肌收缩减弱。 7、 滴加3%乳酸溶液
分析：H与Ca的竞争机制，导致心肌细胞动作电位2期内流Ca2+减少，细胞质Ca2+浓度减少，心肌的收缩活动也随之减弱。
六、【注意事项】
1. 制备蛙心标本时，勿伤及静脉窦。
2. 上述各实验项目，一旦出现作用应立即用正常任氏液换洗，以免心肌受损，而且必须
+
2+
待心搏恢复正常后方能进行下一步实验。
3. 尽量选用健壮、体大的雄性蟾蜍，手术过程中注意保护心脏，避免损伤。 4. 实验中及时用任氏液冲洗心脏，待曲线恢复平稳后再进行下一步操作。
5. 每次更换任氏液都必须保持灌流液液面高度恒定，以免因灌流量变化而影响结果。 6. 严格控制每次药品加入量，先加一滴，效果不明显再加一滴。
7. 吸滴瓶中的任氏液和吸蛙心套管内溶液的吸管应区分专用，不可混淆使用，以免影响
实验结果。
七、【讨论】
1. 离体蛙心制备好后，有时候馆内的液面上下移动很不明显，是何原因如何处理 答：离体蛙心制备好后，蛙心插管内的液体应随蛙心室的收缩和舒张活动而上下移动。其实质是：在心室收缩时，心室容积减少，室内压升高，将心室内的液体压入插管内，管内液面上升；在心室舒张的时候，心室容积增大，心室内压减少，将插管内液体吸入心室，管内液面下降。
但是有时候蛙心插管内液面波动不明显，其主要原因是： ⑴ 插管内尖端出现血凝块。
⑵ 插管尖端不在心室腔内，而是在心房或者脉间结缔组织等地方。 ⑶ 插管进入心室腔内过深，以致尖端抵住了心室壁。 ⑷ 蛙心由于长期心肌失血，导致活力下降。
2. 实验过程中，为什么必须保持蛙心插管内液面高度的恒定液面过高或过低会产生怎样的影响
答：在实验过程中，蛙心插管内液面高度发生变化，心脏收缩曲线会相应发生变化。心肌缩短幅度和速度受到前负荷和后负荷的影响。插管液面高度所产生的压力，在心室舒张期末期相当于心肌的前负荷，心室开始收缩的时候，此液体所产生的压力又成为心肌收缩时的后负荷。故高度的改变，进而引起的前后负荷的改变将改变心肌收缩的幅度和频率。
当液面过高时。心缩曲线幅度将降低。因为过高的液面，将使心室前负荷超过了最适前负荷，将导致粗细肌丝过于疏远，而导致收缩的潜力减少，心肌收缩不再增加或下降。而类似的，过高的后负荷，也使心肌收缩的幅度和速度大大下降。而当液面过低时，心室收缩的幅度也会减少。因为前负荷过小，将导致粗细肌丝过于接近，而导致收缩的潜力减少，实际上，此时由于前负荷的减少导致心室收缩的效力的减少比前负荷增加而导致的还有明显。类似的，后负荷相应的减少也会导致心室收缩的减弱。所以，在实验中保持最适的液面高度。是取得较好实验结果的前提。
3． 各种离子成分改变蛙心收缩的原理是什么
答：由于心肌细胞生物电活动和收缩过程与离子密切相关，因此，细胞外液中离子浓度升高或降低均会影响到心肌的电生理特性和收缩性。
（1）钾离子的影响 K与静息电位的形成有关。细胞外液K浓度[K]0变化对心肌生理特性的影响较为复杂。高钾：[K＋]0轻度或中度增高时，膜内、外K＋浓度差减小，静息电位绝对值减小，与阈电位差距缩短，因此，兴奋性增高。 [K＋]0显著升高时，由于静息电位绝对值减小过多（膜内达-55mV左右），Na＋通道失活，因而兴奋性降低甚至消失。另外，还使0期去极化速度和幅度减小，传导性降低，导致兴奋传导减慢，甚至传导阻滞。此外，
＋
＋
＋
[K＋]0增高还可提高膜对K＋的通透性，加速K＋外流，动作电位平台期缩短，因此，不应期缩短。此外由于平台期缩短，减少了Ca2＋的内流，加上细胞外K＋与Ca2＋在膜上有竞争性抑制作用，导致心肌收缩功能减弱；
（2）钙离子的影响 细胞外Ca在细胞膜上对Na内流有竞争性抑制作用，称为膜屏障作用。[Ca] 0增高时，Na内流受抑制，细胞0期除极速度与幅度减小，使兴奋性及传导性均降低。[Ca] 0增高使Ca内流增多，因此慢反应细胞0期去极化加快加强，传导性增高，而快反应细胞平台期缩短，有效不应期缩短，复极加速。Ca内流增多，使心肌收缩能力增强。[Ca] 0降低时，所引起的变化与高钙时相反。
（3）钠离子的影响 细胞外液中钠浓度差梯度的变化一般对心肌活动影响不明显。只有当[Na] 0明显增高时，膜内外钠的浓度差梯度增大，因此，快反应细胞Na内流加快，0期去极速度和幅度均增加，导致传导性和自律性增高。同时，Na内流的增多促进细胞内Ca的外运使细胞内Ca浓度降低，因此，心肌收缩能力减弱。反之，当[Na] 0降低，使心肌传导性和自律性降低，心肌收缩能力增强。
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