(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 106222758 A(43)申请公布日 2016.12.14
(21)申请号 201610650160.X(22)申请日 2016.08.09
(71)申请人 中国烟草总公司郑州烟草研究院
地址 450001 河南省郑州市高新技术产业
开发区枫杨街2号(72)发明人 王晨 陈千思 谢小东 李锋
李泽锋 王燃 刘萍萍 金立锋 (74)专利代理机构 郑州优盾知识产权代理有限
公司 41125
代理人 郑园(51)Int.Cl.
C40B 40/06(2006.01)C12N 15/10(2006.01)C12Q 1/68(2006.01)
(54)发明名称
一种基于烟草BAC文库克隆烟草基因的方法(57)摘要
本发明属于分子生物学领域，涉及一种快速、准确的克隆烟草基因的分子生物学方法，具体涉及一种基于烟草BAC文库克隆烟草基因的方法。步骤如下：构建烟草BAC文库；通过烟草BAC文库数据库，查找目的基因对应的烟草BAC编号；以烟草BAC为模板克隆；PCR扩增及结果分析。烟草BAC可以代替cDNA直接作为基因克隆模板，使烟草基因克隆可以摒弃烟草生物体，节约了提取烟草RNA反转录合成cDNA这一步骤的时间；烟草BAC上面包含了烟草完整的遗传信息，使烟草基因克隆更加高效准确特异，避免了序列相似性高的同源基因的干扰。CN 106222758 A权利要求书1页 说明书4页序列表9页 附图4页
CN 106222758 A
权 利 要 求 书
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1.一种基于烟草BAC文库克隆烟草基因的方法，其特征在于：步骤如下：（1）构建烟草BAC文库；（2）通过烟草BAC文库数据库，查找目的基因对应的烟草BAC编号；（3）以烟草BAC为模板克隆；（4）PCR扩增及结果分析。
2.如权利要求1所述的基于烟草BAC文库克隆烟草基因的方法，其特征在于：所述烟草BAC文库采用单克隆分别保存。
3.如权利要求1所述的基于烟草BAC文库克隆烟草基因的方法，其特征在于：所述烟草BAC文库数据库的克隆数覆盖烟草总基因组。
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说 明 书
一种基于烟草BAC文库克隆烟草基因的方法
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技术领域
[0001]本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种基于烟草BAC文库克隆烟草基因的方法。
背景技术
[0002]基因克隆的第一步是获得包含目的基因在内的一群DNA分子，这些DNA分子或来自于目的生物的基因组，或来自目的生物的mRNA反转录合成的双链cDNA分子。由于基因组DNA较大，不利于克隆，所以在实验室通常采用第二种方法来获得目的基因。由于mRNA的表达具有时间和空间的特异性，其反转录合成的cDNA并非包含了目的生物的所有遗传信息，因此以cDNA为模板来克隆目的基因具有一定局限性。在烟草中，我们前期已经完成了烟草BAC文库的构建和测序工作，测序的基因组覆盖度达到6倍左右，并且每一个烟草BAC文库我们都是以单克隆的形式进行保存，克隆总数达到26万多个，因此每一个烟草基因基本都能在烟草BAC文库中找到其存在的实体。
发明内容
[0003]本发明针对现有克隆烟草基因不准确、操作繁琐的技术问题，提出一种基于烟草BAC文库克隆烟草基因的方法。[0004]为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种基于烟草BAC文库克隆烟草基因的方法，步骤如下：（1）构建烟草BAC文库；（2）通过烟草BAC文库数据库，查找目的基因对应的烟草BAC编号；（3）以烟草BAC为模板克隆；（4）PCR扩增及结果分析。
[0005]所述烟草BAC文库采用单克隆分别保存。
[0006]所述烟草BAC文库数据库的克隆数覆盖烟草总基因组。[0007]本发明的有益效果在于：
（1）烟草BAC可以代替cDNA直接作为基因克隆模板，使烟草基因克隆可以摒弃烟草生物体，节约了提取烟草RNA反转录合成cDNA这一步骤的时间；
（2）烟草BAC上面包含了烟草完整的遗传信息，使烟草基因克隆更加高效准确特异，避免了序列相似性高的同源基因的干扰。附图说明
[0008]图1为本发明的技术方案流程图。[0009]图2为基因1的电泳图。
[0010]图3为基因1序列结果对比图。[0011]图4为基因2的电泳图。
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说 明 书
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图5为基因3-7的电泳图。图6为基因8的电泳图。图7为基因9的电泳图。图8为基因10的电泳图。
具体实施方式
[0016]下面结合附图和具体实例对本发明做进一步的详细说明，本发明并不局限于以下实施例。
[0017]实施例1
（1）查找烟草基因对应BAC编号
通过数据库查找所需烟草基因片段对应的烟草BAC编号，从超低温冰箱中取出该菌液，4℃缓慢融化。[0018]（2）以烟草BAC为模板克隆
吸取2μL上述菌液，以此为模板加入基因1的特异引物SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2进行PCR扩增，设置2个重复。[0019]（3）PCR扩增及结果分析
1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，如图2所示，在700 bp附近有清晰特异的目的条带。胶回收目的条带，并克隆测序。如图3所示，将测序结果在烟草基因组数据库中进行Blast比对，结果显示目标序列长度为702 bp，待测片段B与所需烟草基因片段的相似度达100%。这表明PCR扩增出来的片段A是所需基因片段。[0020]实施例2
（1）查找烟草基因对应BAC编号
通过数据库查找所需烟草基因片段对应的烟草BAC编号，从超低温冰箱中取出该菌液，4℃缓慢融化。[0021]（2）以烟草BAC为模板克隆
吸取2μL上述菌液，以此为模板加入基因2特异引物对SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，进行PCR扩增，设置2个重复。[0022]（3）PCR扩增及结果分析
1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，如图4所示，在700 bp附近有清晰特异的目的条带。胶回收目的条带，并克隆测序。将测序结果在烟草基因组数据库中进行Blast比对，结果显示目标序列长度为702 bp，待测片段B与所需烟草基因片段的相似度达100%。这表明PCR扩增出来的片段A是所需基因片段。[0023]实施例3
（1）查找烟草基因对应BAC编号
通过数据库查找所需烟草基因片段对应的烟草BAC编号，从超低温冰箱中取出该菌液，4℃缓慢融化。[0024]（2）以烟草BAC为模板克隆
吸取2μL上述菌液，以此为模板分别加入基因3的特异引物对SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6；基因4的特异引物对SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8；基因5的特异引物对SEQ ID NO：9，SEQ
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说 明 书
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ID NO：10；基因6的特异引物对SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12；基因7的特异引物对SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14进行PCR扩增。[0025]（3）PCR扩增及结果分析
1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，如图5所示，基因3，4，6，7大小均约550bp；基因5大小约250bp，胶回收目的条带，并克隆测序。将测序结果在烟草基因组数据库中进行Blast比对，结果显示目标序列与所需烟草基因片段的相似度达100%。这表明PCR扩增出来的片段A是所需基因片段。[0026]实施例4
（1）查找烟草基因对应BAC编号
通过数据库查找所需烟草基因片段对应的烟草BAC编号，从超低温冰箱中取出该菌液，4℃缓慢融化。[0027]（2）以烟草BAC为模板克隆
吸取2μL上述菌液，以此为模板分别加入基因8的特异引物对SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16；进行PCR扩增，重复扩增两次。[0028]（3）PCR扩增及结果分析
1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，如图6所示，在700 bp附近有清晰特异的目的条带。胶回收目的条带，并克隆测序。将测序结果在烟草基因组数据库中进行Blast比对，结果显示目标序列与所需烟草基因片段的相似度达100%。这表明PCR扩增出来的片段A是所需基因片段。
[0029]实施例5
（1）查找烟草基因对应BAC编号
通过数据库查找所需烟草基因片段对应的烟草BAC编号，从超低温冰箱中取出该菌液，4℃缓慢融化。[0030]（2）以烟草BAC为模板克隆
吸取2μL上述菌液，以此为模板分别加入基因9的特异引物对SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18；进行PCR扩增，重复扩增两次。[0031]（3）PCR扩增及结果分析
1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，如图7所示，在300 bp附近有清晰特异的目的条带。胶回收目的条带，并克隆测序。将测序结果在烟草基因组数据库中进行Blast比对，结果显示目标序列与所需烟草基因片段的相似度达100%。这表明PCR扩增出来的片段A是所需基因片段。
[0032]实施例6
（1）查找烟草基因对应BAC编号
通过数据库查找所需烟草基因片段对应的烟草BAC编号，从超低温冰箱中取出该菌液，4℃缓慢融化。[0033]（2）以烟草BAC为模板克隆
吸取2μL上述菌液，以此为模板分别加入基因10的特异引物对SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20；进行PCR扩增，重复扩增两次。[0034]（3）PCR扩增及结果分析
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1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，如图8所示，在650 bp附近有清晰特异的目的条带。胶回收目的条带，并克隆测序。将测序结果在烟草基因组数据库中进行Blast比对，结果显示目标序列与所需烟草基因片段的相似度达100%。这表明PCR扩增出来的片段A是所需基因片段。
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图2
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图3
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图4
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图6
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