维普资讯 http://www.cqvip.com 第４Ｏ卷 第２期 河南农业大学学报 Ｖｏ１．４０ Ｎｏ．２ ２００６拄 ４月 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｐｔ． ２００６ 文章编号：１０００—２３４０（２００６）０２—０１３０—０３ ＰＡＰ基因ｃＤＮＡ克隆及烟草转基因研究 王燕萍，曹俊剑，刘海礁，崔 红 （河南农业大学国家烟草栽培生理生化研究基地，河南郑州４５０００２） 摘要：以美洲商陆（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ Ｌ．）为材料，利用ＲＴ－ＰＣＲ方法克隆商陆抗病毒蛋白（ＰＡＰ）的ｃＤＮＡ，并构 建双元植物表达载体ｐＢｉｎＡＲｐａｐ．用捕获谊质粒的根癌农杆茵菌株ＬＢＡ４４０４与烟草叶片外植体共培养，并在附加 ３０ ｍｇ・Ｌ Ｋａｎ的ＭＳ＋０．１ ｎａｇ・Ｌ ＩＡＡ＋１．５ ｍｇ・Ｌ ＢＡ的培养基上诱导植株分化，再生芽在附加３０ ｍｇ・Ｌ Ｋａｎ 的ＭＳ培养基上生根，实现再生植株 Ｋａｎ阳性植株经ＰＣＲ—Ｓｏｕｒｔｈｅｒｎ检测筛选，得到ＰＣＲ阳性植株，证明异源ＰＡＰ 基因在烟草基因组中的整合；经过ＲＴ－ＰＣＲ检测，证明ＰＡＰ基因在ＲＮＡ转录水平上有表达；攻毒试验表明，转基 因烟草植株对供试病毒ＴＭＶ具有明显抗性． 关键词：烟草；商陆抗病毒蛋白（ＰＡＰ）；ｃＤＮＡ克隆；基因转导；烟草花叶病 中图分类号：Ｓ ５７２ 文献标识码：Ａ Ｔｈｅ ｃＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ Ｐｏｋｅｗｅｅｄ Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｇｅｎｅ－Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｔｏｂａｃｃｏ ＷＡＮＧ Ｙａｎ－ｐｉｎｇ，ＣＡＯ Ｊｕｎ－ｊｉａｎ，ＬＩＵ Ｈａｉ－ｊｉａｏ，ＣＵＩ Ｈｏｎｇ （Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｈｅｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ４５０００２。Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｏｋｅｗｅｅｄ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｍｅｒｗａｎａ Ｌ．ｗａｓ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅｓ．Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＲＴ－ＲＣＲ，ｉｔ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ａｎｄ ｉｎｓｅａｅｄ ｉｎｔｏ ｂｉｎａｒｙ ｖｅｃｔｏｒ ｕｎｄｅｒ ＣａＭＶ３５ Ｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＢｉｎＡＲ ｐａｐ．Ｔｈｅ ｌｅａｖｅ ｄｉｓｃｓ ｏｆ ｔｏｂａｃｃｏ ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｗｉｔｈ ＰＡＰ ｇｅｎｅ ｖｉａ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｓｈｏｏｔｓ ｗｅｒｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｏｎ ＭＳ ｍｅｄｉｕｍ ｓｕｐｐｌｅ— ｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ３０ ｍｇ。Ｌ～Ｋａｎ．０．１ ｍｇ‘Ｌ～ＩＡＡ ａｎｄ ０．５ ｍｇ’Ｌ一 ＢＡ ａｎｄ ｒｏｏｔｅｄ￣ｏｎ ＭＳ ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈｏｕｔ ｈｏｒｍｏｎｅ．ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｍ ａｎａｌｙｓｉｓ ｐｒｏｖｅｄ ＰＡＰ ｇｅｎｅ ｉｎｔｅｒｇｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｏｎｅ Ｋａｎａｍｙｃｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐｌａｎｔｌｅｔ．ＲＴ— ＰＣＲ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈｅ ＰＡＰ ｇｅｎｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｌｅｔ ｈａｄ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｔ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｌｅｖｅ１．Ｄｉｓｅａｓｅ ｃｈａ１． １ｅｎｇｅ ｔｅｓｔ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｔａｃｈｅｄ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｌｅｔ ｂｙ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｂａｃｃｏ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｗａｓ ｄｒａｍａｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｎｏｎ—ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｔｏｂａｃｃｏ；ｐｏｋｅｗｅｅｄ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＰＡＰ）；ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ；ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ｔｏｂａｃｃｏ ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｌｌｓ 烟草是中国的重要经济作物之一，但由于 洲商陆（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ Ｌ．）植株体内分离出 ＴＭＶ（Ｔｏｂａｃｃｏ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｕｒｓ）等多种病毒的侵染，导致 来的碱性蛋白质，属于Ｉ型核糖体失活蛋白［ ，分 产量与品质严重下降，造成巨大的经济损失．商陆 子量约为３０ ｋｕ．ＰＡＰ具有广谱的抗病毒能力，它对 抗病毒蛋白（Ｐｏｋｅｗｅｅｄ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＰＡＰ）是从美 ＴＭＶ，ＣＭＶ，ＡＭＶ，ＰＶＸ，ＰＶＹ等病毒都具有一定的 收稿日期：２００５—１１—２０ 作者简介：１三燕萍（１９７８一），女，河南焦作人， 读硕ｆ．研究书．从 烟啦， 物技术研究；通讯作者：崔 ｌ 维普资讯 http://www.cqvip.com 第２期 王燕萍等：ＰＡＰ基因ｅＤＮＡ克隆及烟草转基因研究 抑制作用．烟草抗病毒基因工程足快速改良烟草抗 病毒性状的一条有效途径ｌ２ Ｊ．因此，作者拟采用农 杆菌介导法将对病毒具广谱抗性的商陆抗病毒蛋 白基因导人烟草，以获得能够抵抗多种病毒侵染的 工程植株． １材料与方法 １．１材料 烟草品种Ｋ３２６（Ｎｉｃｏｔｉｎａｎ ｔａｂａｃｕｍ）种子；美洲 商陆种子；农杆菌株ＬＢＡ４４０４，由本实验室保存． １．２方法 １．２．１ ＰＡＰ基因克隆与载体构建 采用异硫氰酸 胍．苯酚一氯仿法提取美洲商陆叶片总ＲＮＡ，以其为 模板，ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）为引物，在ＡＭＶ逆转录酶的作用下， 合成ｅＤＮＡ第一链．参照已发表的ＰＡＰ基因序列，设 计了两端引物：５’端引物Ｉ ５’ｃＧＧＧＡＴｃｃＡＴＧＡＡＧ． ＧＴＧＡ１１Ｇｃｒ１］： 队ＧＴ（２８ ｂｐ）。３’端引物Ｕ ５’ＡＡＡＧＴＣ— ＧＡｃＴｃＡＧＡ ｃｃ ＩＴｃＡＡ 虹ＩＡＧ ｃＡｃ（３２ ｂｐ）．以合成 的ｅＤＮＡ第一链为模板进行ＰＣＲ，反应条件为９４ ｅ【＝ 变性４０ ｓ，５０ ｏＣ退火５ ｍｉｎ，７２ ｏＣ延伸１．５ ｍｉｎ，共３Ｏ 个循环．以Ｂａｒｎ／／Ｉ和Ｓａｌ Ｉ双酶切ｐＵＣｐａｐ及植物双 元载体ＢｉｎＡＲ，宝生物回收试剂盒（Ｃｏｄｅ Ｎｏ．Ｄ３０１ ＣＡ）回收ＰＡＰ片段和双酶切后的ＢｉｎＡＲ，使用宝生物 ＤＮＡ连接试剂盒（Ｃｏｄｅ Ｎｏ．６０２２ ＣＡ）连接． １．２、２ 农杆菌的转化 采用冻融法转化．制备 ＬＢＡ４４０４菌株感受态，加入ｐＢｉｎＡＲｐａｐ质粒，冰浴３Ｏ ｎｆｉｎ，置液Ｎ，中冷冻２ ｍｉｎ，迅速移入３７℃浴中孵育５ ｍｉｎ．加１ ｍＬ ＹＥＢ培养液，２８℃，轻轻摇动培养３～４ ｈ，收集菌体，重悬于０．１ ｍＬ ＹＥＢ培养基中，涂布于 含卡那霉素２０ ｍｇ・Ｌ 的ＹＥＢ平板上，于２８℃培养 ２ ｄ后挑选抗性菌落，并进行分子检测． １．２．３ 烟草转化 采用叶盘转化法．取烟草无菌 苗叶片，剪成５ ｍｍ×５ ｍｍ小块，在活化稀释后的 农杆菌菌液中浸泡，吸干表面菌液，在ＭＳ培养基 上共培养２ ｄ，转入附加５００ ｍｇ・Ｌ 羧苄青霉素的 Ｍｓ培养基上除菌，后转至附加３Ｏ ｍｇ・Ｌ 卡那霉素 的ＭＳ＋０．１ ｍｇ・Ｌ ＩＡＡ＋１．５ ｍｇ・Ｌ ＢＡ培养基上 分化，不定芽长到１ ｃｍ以上时转入附加３Ｏ ｍｇ・Ｌ Ｋａｎ的ＭＳ培养基上，在２５℃，２ ０００ ｌｘ光照１２ ｈ条 件下进行生根培养． １．２．４ ＤＮＡ提取和ＰＣＲ—Ｓｏｕｔｈｅｍ检测 采用 ＣＴＡＢ法ＤＮＡ提取．以ＰＡＰ基因特异引物扩增其问 约１ ｋｂ大小的片断．反应条件：９４℃变性５０ ｒａｉｎ， ５５℃退火１ ｍｉｎ，７２ ｏＣ反应１．５ ｍｉｎ，７２ ｏＣ延伸５ ｍｉｎ，３Ｏ个循环．ＰＣＲ扩增产物在质量分数为０．８％ 琼脂糖凝胶上分离，吸印法将扩增产物转移至尼龙 膜，以ＰＡＰ基凶为探针，采用地高辛标记ＤＮＡ杂交 试剂盒（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ公司，货号：１７４３８），按 规定程序进行预杂交、杂交洗膜和显色． １．２．５ ＲＮＡ提取和ＲＴ—ＰＣＲ检测 采用Ｔｒｉｚｏｌ法 提取烟草叶片的总ＲＮＡ．采用ＴａＫａＲａ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ （ＡＭＶ）Ｖｅｒ．３．０反转录ＰＣＲ试剂盒将总ＲＮＡ按规 定程序进行ＲＴ反应和ＰＣＲ反应，通过琼脂糖凝胶 电泳分析ＰＣＲ扩增产物． １．２．６ 转基因植株ＴＭＶ抗性鉴定 分别将普通 栽培品种Ｋ３２６、转基因阳性幼苗移栽入土１５ ｄ后， 接种ＴＭＶ病毒．以该病毒侵染心叶烟（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ），ＴＭＶ病毒极易侵染此种野生品种，ｌ并在 其中大量积累．将感病叶片在磷酸缓冲液中磨碎， 以石英砂摩擦接种法接毒，进行观察记载． ２结果与分析 ２．１ ＰＡＰ基因克隆与载体构建 提取美洲商陆ＲＮＡ，经反转录合成第一链ｃＤ— ＮＡ。以其为模板，用特异引物扩增，得到１ ｋｂ左右 的ＤＮＡ片断（图１）．将ＰＣＲ扩增产物回收、纯化。 克隆到ｐＵＣ１９载体上，经测序，ＰＡＰ ｅＤＮＡ全长９４５ ｂｐ，编码３１４个氨基酸． １．ＤＬ ２０００ ＤＮＡ Ｍａ￣ｅｒ ２．ＰＣＲ广：物ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｔ－ｔ 图１ ＰＣＲ产物凝胶电泳 Ｆｉｇ．１ Ａｇｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ 质粒ｐＵＣｐａｐ经ＢａｍＨ Ｉ和Ｓ。ｚ Ｉ双酶切后回收 的ＰＡＰ片断，与同样经ＢａｍＨ Ｉ和Ｓａｌ ｉ双酶切后 植物双元载体ＢｉｎＡＲ连接．所得的重组子ｐＢｉ— ｎＡＲｐａｐ，经酶切得到了１ ｋｂ左右的目的片断，经测 序，证明ＰＡＰ片断已插入植物双元表达载体ＢｉｎＡＲ 中（图２）． ２．２烟草遗传转化及Ｋａｎ阳性植株筛选 烟草叶片外植体与农杆菌的共培养后，在附加 ３０ ｍｇ・Ｌ Ｋａｎ的分化培养基（ＭＳ＋０．１ ｍｇ・Ｌ ＩＡＡ ＋１．５ ｍｇ・Ｌ ＢＡ）上进行光照培养，未经共培养的 维普资讯 http://www.cqvip.com １３２ 河南农、 人学学报 第４Ｏ卷 叶叶片外植体在相同培养条件下培养，作为阴性对 ｌ Ｔ－ｂｏｒｄｅ ｒ（Ｒ） 图２植物表达载体ｐＢｉｎＡＲｐａｐ的构建 Ｆｉｇ．２ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ ｐＢｉｎＡＲｐａｐ 照；未经共培养的叶片外植体在无Ｋａｎ筛选压力的 分化培养基中培养，作为阳性对照．２周后，在叶片 边缘出现少量芽点，但分化频率要明显低于阳性对 照，而阴性对照则没有分化，叶片逐渐黄化直至灰 白色．待芽点分化出小叶后，将其剥离，接种在ＭＳ 培养基中进行生根，得到颜色浓绿、根系发达的 小苗． ２．３烟草Ｋａｎ阳性植株的分子检测 随机选择Ｋａｎ阳性苗进行ＰＣＲ检测，１株检测 到预期的１ ｋｂ片段，阴性对照未扩增出任何谱带 （图３）．为证实扩增条带为目的产物，将ＰＣＲ产物 Ｍ Ｍ．ＤＩ２０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ １．ＰＡＰ质粒ＰＡＰ ｐｌａｓｍｉｄ ２．无菌苗Ａｓｅｐｓｉｓ ｐｌａｎｔｌｅｔ ３．转基因植株Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｌｅｔ 图３转基因植株ＰＣＲ检测 Ｆｉｇ．３ ＰＣＲ ｔｅｓｔ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｌｅｔ 凝胶分离后，转移到尼龙膜上，与地高辛标记的 ＰＡＰ探针杂交，杂交结果证明ＰＡＰ外源基因已整 合进烟草细胞核基因组中（图４）． 提取转基因株系的总ＲＮＡ ２０ ｇ，进行反转录 ＲＴ—ＰＣＲ反应，结果如图５所示．可以看出，转基因 株系出现预期的１ ｋｂ片段的条带，证明ＰＡＰ外源 基因在ＲＮＡ水平上有表达． １．ＰＡＰ质粒ＰＡＰ ｐｌａｓｍｉｄ ２转基因植株Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｌｅｔ 图４转基因植株ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交 Ｆｉｇ．４ ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｔｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｌｅｔ １ ２ ３ ４ １．ＤＬ２０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ２．ＰＡＰ质粒ＰＡＰ ｐｌａｓｍｉｄ ３．无菌苗Ａｓｅｐｓｉｓ ｐｌａｎｔｌｅｔ ４．转基因植株Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｌｅｔ 图５转基因植株ＲＴ－ＦＣＲ Ｆｉｇ．５ ＲＴ・ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｐ￣ｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｌｅｔ ２．４转基因烟草的抗病性分析 用新鲜ＴＭＶ毒汁对转基因植株及阴性对照植 株叶片进行室内接毒实验，对照叶片１５ ｄ后出现 典型的病斑，而转基因叶片无显著症状，说明转基 因植株对ＴＭＶ有一定的抗性． ３ 讨论 烟草抗病毒转基因研究己有了一套比较系统 的程序和方法，并已取得了一定的成就，如北京大 学植物基因工程与蛋白质工程国家重点实验室与 辽宁丹东农科所协作，利用ＴＭＮ—ＣＰ基因转育出抗 ＴＭＶ香料烟品系“ＰＫ一８７３”，又以转基因材料ＭＳＧ２８ 为母本与９００８２（转ＣＭＮ—ＣＰ基因）杂交选育出抗 ＣＭＶ的烤烟品系“ＰＫ一８６３”ｌ３ Ｊ．但当前抗病毒转基 因烟草抗病能力主要表现为延迟和减轻发病，且抗 性单一ｌ４ｊ．近年来，随着分子生物学的向前发展，人 们对ＰＡＰ的认识也不断地得到深化，许多研究者 在ＰＡＰ测序后，都开始了ＰＡＰ的转基因研究【 ，将 ＰＡＰ基因转入植物体内后，受体可以产生对多种病 毒的抗性，就可以避免目前绝大多数抗病毒转基因 植物只抗单个病害而对多种病害无抗性的局面． （下转第１４１页） 维普资讯 http://www.cqvip.com 第２期 范围强等：植物牛长调节物质对泡桐丛枝病株幼苗形态和叶片蛋白质含量变化的影响 ｌ４ （上接第１３２页） ［３］ ｒ国华．烟草转基冈研究的动态与展单［Ｊ］．黑龙江 １９９３年Ｍｏｎｓａｎｔｏｎ公司成功地将ＰＡＰ基因导人马 农垦师专学报，２０００（２）：８１—８３． 铃薯，使其转基因植株及其后代获得了广谱的植物 ［４］ ＮＥＬＳＩＮ Ｒ Ｓ．Ｌｅｓｉｏｎｓ ａｎｄ ｖｉｒｕｓ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ 病毒抗性ｌ ，在国内也有此类报道，张海燕等ｌ７， ］ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｌａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ｏｆ 对ＰＡＰ的ｅＤＮＡ进行克隆、测序，而后构建了植物 ｔｏｂａｃｃｏ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ【Ｊ Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９８７，１５８：１７６—１３２． 表达载体Ｐｂｐ２１，采用农杆菌介导法和激光微束穿 ［５］付呜佳，吴组建，林奇英，等．美洲商陆抗病毒蛋白研 究进展［Ｊ］．生物技术通讯，２００２，１３（１）：６６—６９． 刺法，将ＰＡＰ的ｅＤＮＡ导入油菜获得抗芜菁花叶病 【６ Ｊ Ｌ１ＤＧＥ Ｊ Ｋ，ＫＡＮＩＥＷＳＫＩ Ｗ Ｋ，ＴＵＭＥＲ Ｎ Ｅ．Ｂｒｅａｄ—ｓｐｅｃ— 毒（ＴｕＭＶ）的油菜植株．可见，对于将ＰＡＰ基因导入 ｔｒｕｍ ｖｉｕｒｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｐｏｋｅ‘ 植物的研究已获得一定进展．本试验只是对 代 ｗｅｅｄ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，１９９３，９Ｏ 苗期阳性植株进行攻毒试验，对于Ｔ．代性状分离、 （１５）：７０８９—７０９３． 其基因遗传稳定性及大田实际生产抗病性，还有待 ［７］张海燕，刘桂珍，陈正华．商陆抗病毒蛋白ｅＤＮＡ的 于进一步检测． 克隆、测序及其植物表达载体的构建ｆＪ］．植物学报， １９９９．４１（２）：２２６—２２８． 参考文献 ［引 张海燕，田颖ＪＩＩ，周奕华，等．将商陆抗病毒蛋白 【１］ ＩＲＶＩＮ Ｊ Ｄ．Ｐｕｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐａｒｔｉａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ （ＰＡＰ）ｅＤＮＡ导人油菜获得抗病毒转基因植株［Ｊ］，科 ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｎｅｒｉｃａｎａ ｗｈｉｃｈ ｉｎｈｉｂｉｔｓ 学通报，１９９８，４３（２３）：２５３４—２５３７． ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ［Ｊ］．Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ， １９７５，１６９：５２２—５２８． ［２］ 黄文川，论我国烟草抗病毒基因工程［Ｊ］．安徽师范大 学学报，１９９９，２２（３）：２８３—２８４．
