中国烟草科学Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３－０６，３４（３） 烟草ＣＯＮＳＴＡＮＳ同源基因的克隆与分析 陆 莹 ，一，刘艳华 ，任 民 ，牟建民 ，张兴伟 ，一，孙玉合 ，王志德 （１．中国农业科学院烟草研究所，青岛２６６１０１；２．中国农业科学院研究生院，北京１０００８１） 摘要：日照长度影响植物的生长发育，在拟南芥中ＣＯＮＳＴＡＮＳ是植物光周期开花途径中的关键基因。利用同源序列法结 合ＲＡＣＥ技术从短日照烟草品种Ｋｕｔｓａｇａ．Ｍａｍｍｏｔｈ１０中分离出了开花时间相关的ＣＯ（ＣＯＮＳＴＡＮＳ）同源基因，并命名为 ＮｔＣ０１（基因登录号ＪＮ０２２５３５．１）。经序列分析，ＮｔＣＯ１全长１４９３ ｂｐ，具有完整的开放阅读框（ＯＲＦ，８１～１２９２ ｂｐ），编 码４０３个氨基酸；具有ＣＯ蛋白典型的结构域；氨基末端有两个Ｂ．ｂｏｘ结构，羧基末端有ＣＣＴ保守结构域。氨基酸同源性 比对发现，ＮｔＣＯ１与茄科ＣＯ同源蛋白一致性最高，同马铃薯ＣＯ序列一致性达到８６．５％；与拟南芥ＣＯ蛋白和水稻Ｈｄｌ氨 基酸序列一致性也分别达到５０％和４３．７％。基因表达分析表明，ＮｔＣＯ１在叶片中优势表达，茎中次之，根中最弱。 关键词：ＣＯＮＳＴＡＮＳ（ＣＯ）基因；烟草；克隆；分析；ＮｔＣＯ１ 中图分类号：￥５７２．０１ 文章编号：１００７—５１１９（２０１３）０３．００６０．０５ ＤＯＩ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１００７．５１１９．２０１３．０３．１２ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ＣＯＮＳＴＡＮＳ Ｈｏｍｏｌｏｇ ｆｒＯｍ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ＬＵ Ｙｉｎｇ Ｉ．，ＬＩＵ Ｙａｎｈｕａ ，ＲＥＮ Ｍｉｎ ，ＭＵ Ｊｉａｎｍｉｎ ，ＺＨＡＮＧ Ｘｉｎｇｗｅｉ１，－ＳＵＮ Ｙｕｈｅ ，ＷＡＮＧ Ｚｈｉｄｅ１ ，（１．Ｔｏｂａｃｃｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆＣＡＡＳ，Ｑｉｎｇｄａｏ ２６６１０１，Ｃｈｉｎａ；２．Ｇｒａｄｕａｔｅ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆＣＡＡＳ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８１，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｄａｙ ｌｅｎｇｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｍａｎｙ ｐｌａｎｔｓ．Ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ，ｔｈｅ ａｐ （ｃｏ）ｇｅｎｅ ｉｓ ａ ｋｅｙ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｆｌｏｒａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｃＤＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ＣＯ ｈｏｍｏｌｏｇ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ＣＶ．Ｋｕｔｓａｇａ Ｍａｍｍｏｔｈ １０ ａｎｄ ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ ＮｔＣＯ１（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ，ＪＮ０２２５３５．１）．Ｔｈｅ ｆｕｌｌ ｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗａｓ １４９３ ｂｐ ｗｉｔｈ ａｎ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）ｏｆ １２１ １ ｂｐ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ４０３ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ．Ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ＮｔＣＯ１ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｔｗｏ Ｂ—ｂｏｘ－ｔｙｐｅ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒｓ ａｎｄ ａ ＣＣＴ ｄｏｍａｉｎ．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＮｔＣＯ １ ｓｈａｒｅｄ ｈｉｇｈ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｗｉｔｈ ＳｔＣＯ（８６．５％）ｆｒｏｍ Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ，ＡｔＣＯ（５０％）ｆｒｏｍ Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ａｎｄ Ｈｄｌ（４３．７％）ｆｒｏｍ Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ． Ｓｅｍｉ－ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＮｔＣＯ１ ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ａｎｄ ｓｔｒｏｎｇｌｙ ｉｎ ｌｅａｆ ｔｉｓｓｕｅｓ ｂｕｔ ｗｅａｋｌｙ ｉｎ ｓｔｅｍ ａｎｄ ｒｏｏｔ ｔｉｓｓｕｅｓ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＣＯＮＳＴＡＮＳ（ＣＯ）ｇｅｎｅ；ｔｏｂａｃｃｏ；ｃｌｏｎｉｎｇ；ａｎａｌｙｓｉｓ；ＮｔＣＯ１ 开花是植物由营养生长向生殖生长转化的重 要过程，光周期是植物开花的重要途径之一。 ＣＯＮＳＴＡＮＳ基因（ＣＯ）编码一个具有锌指结构的 转录因子，是光周期途径中的关键基因 之】。Ｐｕｔｔｅｆｉｌｌ 性状基因座利用图位克隆获得Ｈｄｌ基因，序列分析 表明Ｈｄｌ基因与ＣＯ基因同源。利用模式植物拟南 芥ＣＯ基因和水稻Ｈｄｌ基因的序列，人们利用同源 克隆或筛选文库的方法在小麦［９］、美洲黑杨【１刚、马 铃薯【１ｌＪ等多种植物中均克隆到了ＣＯ同源基因。 ＣＯ基因对光周期的响应起着关键作用，植物 等【３】最早在拟南芥突变体中采用图位克隆的方法分 离出ＣＯＮＳＴＡＮＳ基因（ＣＯ），ＣＯ基因编码的ＣＯ 蛋白含有与蛋白作用相关的Ｂ—ｂｏｘ和与核定位有关 的ＣＣＴ（ＣＯ、ＣＯ—Ｌｉｋｅ和ＴＯＣ１）两类重要的保守 首先通过光敏色素（ＰｈｙＡ、ＰｈｙＢ、 ｙＣ、ＰｈｙＤ、 ＰｈｙＥ）和隐花色素（Ｃｒｙｌ、Ｃｒｙ２）２类光受体接受 光信号，ＣＯ基因在光受体和生物节律钟的共同调 结构域［ ］。Ｙａｎｏ 埘水稻抽穗期的一个重要数量 ２００５１５０１号｝；国家烟草专卖局科技项目“烟草ｃＤＮＡ文库构建及重要基因表达谱研究”（１１０２００７０１０２１） 基金项目 中国种质资源平台建设｛国烟办综［作者简介 陆莹，女，硕士研究生，研究方向为烟草光周期。Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｕｙｉｎｇ０９２２＠１２６．ｃｏｍ。 通信作者，Ｅ—ｍａｉｌ：ｗｚｄｙｃｓ＠ｔｏｍ．ｃｏｍ 修回日期：２０１２．０６．３０ １２．０６ 收稿日期 ２Ｏｌ１第３期 陆莹等：烟草ＣＯＮＳＴＡＮＳ同源基因的克隆与分析 ６１ 控下，表达量呈现节律性变化，ＣＯ蛋白下游 基因ＦＴ和ＳＯＣ１的表达控制开花时间 。 大多数烟草品种对光照的反应是中性的，只有 多叶型品种是典型的短日照作物。目前对于烟草光 周期的反应只集中于生理生化的研究［１３－１５］，但烟草 开花的分子机理还不清楚。为更好地理解光周期对 烟草开花的分子机制及ＣＯ基因的表达模式和 功能，本研究以多叶型烟草品种Ｋｕｔｓａｇａ Ｍａｍｍｏｔｈ １０为材料，根据马铃薯ＣＯ基因序列设计特异引物， 克隆获得ＮｔＣＯ１基因，分析其结构特征和组织器官 特异性表达。 分别取上述材料各５０－１ ００ ｍｇ用液氮研磨后， 采用Ｔｒｉｚｏｌ 试剂盒（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）提取总ＲＮＡ，将 所提取的总ＲＮＡ用ＴＥ稀释后分别在２６０ ｎｍ、 ２８０ ｎｍ紫外光测定ＯＤ值。并用１．２％的琼脂糖凝 胶电泳检测ＲＮＡ的完整性。ＮｔＣＯ１中间片段获得 和基因表达分析所需的ｃＤＮＡ模板，采用Ｏｌｉｇａ ｄｔ （１８）和Ｍ．ＭＬＶ逆转录酶（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃａｔ．ＮＯ． Ｍ１７０５）合成。利用ＳＭＡＲＴＴＭ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ扩增 试剂盒（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｃａｔ．ＮＯ．６３４９１４）分别合成ＮｔＣＯ１ 基因全长获得所需的５ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ和３ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ。 １材料与方法 １．１材料 １＿３烟草ＣＯＮＳＴＡＮＳ基因的克隆及全长获得 将马铃薯（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）ＣＯ基因序列 （基因序列登录号ＡＭ８８８３８９．１）在茄科基因数据 库（ｈｔｔｐ：／／ｓｏｌｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｎｅｔ／）内进行比对，获得７条 供试材料为短Ｆｔ照烟草ｋｕｔｓａｇａ ｍａｍｍｏｏｔｈ １０ （Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ＣＶ．Ｋｕｔｓａｇａ．Ｍａｍｍｏｔｈ １ ０）由 烟草ＥＳＴ序列，使用ＤＮＡＭＡＮ进行拼接，得到一 条拼接序列。根据这一片段，应用引物设计软件 Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５．０设计一对引物ＣＯ．Ｆ １和ＣＯ—Ｒ１。 国家烟草中期库提供，２０１１年秋种植于中国农业科 学院烟草研究所温室内。种子催芽后播种于育苗 盘，发芽后转入光照培养箱（昼／夜温度为 ２７℃／２２￣Ｃ，光照强度为７００～９００ ｋｔｍｏｌ／ｍ２ｓ，光周期 ８～１６ ｈ，湿度保持在６５％～７５％ｏ待幼苗期第３片 真叶长出时取根、茎（第１、２片真叶之间）和第３ 以ｃＤＮＡ第一链做模板进行ＰＣＲ扩增，扩增产物 测序。根据获得序列，设计５ ＲＡＣＥ引物ＣＯ．ＲＩ 和３ ＲＡＣＥ引物ＧＳＰ２，以５ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ和 ３ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ为模板，以ＧＳＰ１和ＧＳＰ２及 ＳＭＡＲＴ Ｍ ＡＣＥ ＲｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ提供的通 用引物ＵＰＭ，进行ＰＣＲ扩增，克隆、测序获得５ 片真叶，待营养生长ｌ０～１２片真叶时取根、茎（第 ５、６片真叶之间）和第８片真叶，现蕾期取根茎（第 ｌ３、ｌ４片真叶之间）和第１５片真叶，液氮速冻后 保存于 ７０￣Ｃ备用。 １．２ ＲＮＡ提取与ｃＤＮＡ第一链的合成 端序列和３ 端序列。将５ 端序列和３ 端序列进行拼 接获得ＮｔＣＯ１基因全长序列。以上引物合成与测序 均在英潍捷基（上海）贸易有限公司进行，引物序 列信息见表１。 表１本实验所用到的引物 Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ 中国烟草科学 Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，２０００，６７：６３—７ １． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，２０００，１２：８８５－９００． ２０１３年第３４卷 ［７】Ｒｏｂｓｏｎ Ｆ，Ｃｏｓｔａ Ｍ Ｍ，Ｈｅｐｗｏｒｔｈ Ｓ Ｒ，ｅｔ ａ１．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｄｏｍａｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ—ｔｉｍｅ ［１３］王秀荣．短日照对烤烟多叶品种生长发育的影响『Ｊ］． 中国烟草，１９９１（３）：３７ ４０． ｇｅｎｅ ＣＯＮＳＴＡＮＳ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｂｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ａｌｌｅｌｅｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，２００１，２８： ６１９—６３１． ［１４】颜合洪，赵松义．生态因子对烤烟品种发育特性的影响 ［Ｊ］．中国烟草科学，２００１，２２（２）：１５－１８． 【１５］段玉琪，金磊，杨宇虹，等．短臼照对烤烟花芽分化及 ［８］Ｙａｎｏ Ｍ，Ｋａｔａｙｏｓｅ Ｙ，Ａｓｈｉｋａｒｉ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｈｄｌ，ａ ｍａｊｏｒ ｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｔｒａｉｔ ｌｏｃｕｓ ｉｎ ｒｉｃｅ，ｉｓ ｃｌｏｓｅｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ ｔｉｍｅ ｇｅｎｅ 生物学性状的影响［Ｊ］．中国农业科技导报，２０１１，１３ （３）：１０８—１１２． ＣＯＮＳＴＡＮＳ［Ｊ１．Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，２０００，１２：２４７３—２４８３． 『９１ Ｎｅｍｏｔｏ Ｙ，Ｋｉｓａｋａ Ｍ，Ｆｕｓｅ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｗｈｅａｔ ｇｅｎｅｓ ｗｉｔｈ ［１ ６］Ｇｒｉｆｉｆｔｈｓ Ｓ，Ｄｕｎｆｏｒｄ Ｒ Ｐ，Ｃｏｕｐｌａｎｄ Ｇ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ＣＯＮＳＴＡＮＳ－Ｌｉｋｅ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｉｎ ｂａｒｌｅｙ，ｒｉｃｅ ａｎｄ ｈｏｍｏｌｏｇｙｔｏ ｔｈｅ ＣｏＮｓＴＡＮｓ ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ ｔｉｍｅ ｇｅｎｅ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏ１．，２００３，１３１：１８５５—１８６７． 【１ ７］Ｌｉｕ Ｊ，Ｙｕ Ｊ，ＭｃＩｎｔｏｓｈ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ＣＯＮＳＴＡＮＳ ｏｒｔｈｏｌｏｇ ｆｒｏｍ Ｐｈａｒｂｉｔｉｓ ｎｉ１ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｏｌｅ ｉｎ ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００１，１２５：１８２１－１８３０． ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｉｃｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，２００３，３６：８２—９３． 【１０］Ｙｕｃｅｅｒ Ｃ，Ｈａｒｋｅｓｓ Ｒ Ｌ，Ｌａｎｄ Ｓ Ｂ，ｅｔ ａ１．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｔ ＣｏＮＳＴＡＮｓ—ＬＩＫＥ ｇｅｎｅｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｐｏｐｕｌｕｓ ｄｅｌｔｏｉｄｅｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２， １６３：６１５－６２５． ［１８】Ｒｏｂｅｔｒ Ｌ Ｓ，Ｒｏｂｓｏｎ Ｆ，Ｓｈａｒｐｅ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ ｔｉｍｅ 【ｌ１］Ｄｒｏｂｙａｚｉｎａ Ｐ Ｅ，Ｋｈａｖｋｉｎ Ｅ Ｅ．Ａ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｈｏｍｏｌｏｇ ｏｆ ＣＤＡ 翻 ｉｎ ｐｏｔａｔｏ［Ｊ］．Ｒｕｓｓｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００６，５３（５）：６９８—７０ １． ｇｅｎｅ ＣＯＮＳＴＡＮＳ ｉｎ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９８，３７：７６３—７７２． ［１９］Ｚｈａｎｇ Ｊ Ｘ，Ｗｕ Ｋ Ｌ，Ｔｉａｎ Ｌ Ｎ，ｅｔ ａ１．Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ＣＯＮＳＴＡＮＳ－Ｉｉｋｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ［１ ２］Ｏｎｏｕｃｈｉ Ｈ，Ｉｇｅｎｏ Ｍ Ｉ，Ｐｅｆｉｌｌｅｕｘ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｐｌａｎｔｓ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＣｏＮＳＴＡＮｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ ｎｏｖｅｌ Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ｈｙｂｒｉｄａ［Ｊ］．Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａｅ Ｐｌａｎｔａｒｕｍ， ２０１ １，３３（２）：４０９—４１７． ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｍｏｎｇ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ—ｔｉｍｅ ｇｅｎｅｓ［Ｊ］． 《烟草科技》２０１３年第３期目次 ０５基于烟叶原料化学特性的卷烟配方叶组分组方法………………………………………………王晓辉，易斌，谭国治，等 ０８ ＫＬＤ２—３两段式滚筒烘丝机控制模式研究………………………………………………………张炜，刘江生，王道宽，等 １２复烤温度对片烟收缩率及大小分布的影响……………………………………………………．徐大勇，李新锋，范明登，等 １７基于ＮＩ Ｓｉｎｇｌｅ—ＢｏａｒｄＲＩＯ的嵌入式烟支质量控制系统………………………………………………．肖亚平，周密，唐磊 ２０ ＦＯＣＫＥ ７００Ｓ硬盒包装机烟库分烟隔板的改进………………………………………………………………尊Ｂ建娟，马文静 ２３ ＦＯＣＫＥ ７５０烟包转角输入装置同步齿形带跑偏问题的解决……………………………………………………………刘伟忠 ２５ ＧＤＸ２包装机组ＣＨ小包透明纸检测系统的设计应用……………………………………………………………………罗彩丽 ２７聚类分析法监控不同存放期复配烟用香精的质量稳定性………………………………………孔浩辉，陈翠玲，伍锦呜，等 ３１ ＨＩＬＩＣ—ＭＳ／ＭＳ测定家兔血液中的ＮＮＫ及其７种代谢物………………………………郎海磊，王３７制丝线主要热处理工序前后原料致香成分差异性解析…………………………………………朱４３ ＬＣ—ＭＳ／ＭＳ法测定卷烟主流烟气中的丙烯酰胺………………………………………………王异，赵贝贝，等 泽，等 阁，等 勇，何邦华，刘冰，蔡君兰，赵４７微波消解。石墨炉原子吸收光谱法检测烟草及烟草制品中的硒含量…………………………．胡立中，胡永华，葛少林，等 ５０ ＧＣ／ＭＳ结合化学计量学用于复杂香精配方中香料成分的定性识别…………………………卢红兵，孔波，魏维伟，等 ５４卷烟燃吸模拟装置的设计与应用………………………………………………………………．．曹得坡，夏巧玲，郭吉兆，等 ６１ 多聚磷酸铵对造纸法再造烟叶热解燃烧特性和感官质量的影响………………………………．．周顺，宁敏，徐迎波，等 ６７烟草侧芽生长相关基因克隆及ＲＮＡｉ载体的构建转化……………………………………………．陈兴江，蔡刘体，郑少清 ７２不同土壤改良剂对烟草吸收镉的影响……………………………………………………………陈钊，高远，张艳玲，等 ７７烤烟品种Ｋ３２６内生细菌分离、抗黑胫病菌株筛选及种群组成分析…………………………．奚家勤，冯云利，薛超群，等
