维普资讯 http://www.cqvip.com ２２ 中国兽医杂志２００７年（第４３卷）第１０期 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ 鸡ＩＬ－１ ２的基因克隆与序列分析 董长贵 。，何桂梅 ，乔 健 ，赵立红 ，董长宝。，邓光存 ，田 勇 ，王 勋 （１．中国农业大学动物医学院，北京海淀１０００９４；２．中国科学院北京基因组研究所，北京西城１００８６４； ３．陕西省气象局，陕西西安７１００１ ５） 中图分类号：Ｑ７８６ 文献标识码：Ｂ 文章编号：０５２９—６００５（２００７）１０－００２２—０２ ＩＬ一１２是一个７０ ｋＤ的异二聚体细胞因子。由４０ ｋＤ（Ｐ４０）和３５ ｋＤ（Ｐ３５）两条多肽链组成，编码这 两条链的基因位于两条不同的染色体上，各自有不 同的调节机制 。Ｐ３５、Ｐ４０亚单位必须在同一细胞 表达才能产生具有生物活性的异二聚体Ｐ７０单体， Ｐ４０单体无生物活性 一。ＩＩ 一１２的主要功能是在一 系列病理、生理变化中促进ＴＨ１细胞增殖、分化、 Ｄｅｇｅｎ Ｗ．Ｇ．Ｊ．等 从经ＣｏｎＡ刺激的ＣＥＦ细胞中 克隆到了ＩＩ 一ｌ２，而国内对禽的ＩＬ～ｌ２研究起步较 晚，为深入探讨ＩＬ—ｌ２的表达机理，作者克隆了 鸡ＩＬ—ｌ２ Ｐ４０和Ｐ３５基因并作了分析，为进一步表 达鸡ＩＬ—ｌ２并深入研究其功能奠定了基础，现将试 验结果报告如下。 １材料与方法 活化，还可以促进ＮＫ细胞增殖、分化。在体内ＩＩ 一 １２可以增强机体抵抗细菌和寄生虫感染的能力，促 进抗肿瘤免疫，影响抗病毒效应包括ＨＩＶ；同时，它 的过度表达可导致自身免疫性疾病和致死性炎症反 应＿３ 。Ｐ４０仅限于在一些细胞如巨噬细胞、单核细 胞、树突状细胞等细胞中表达，且表达受高度。 １．１ 实验动物本实验室诊断为感染大肠杆菌的病鸡。 １．２工具酶与主要试剂 所用Ｍ～ＭＬＶ购自Ｐｒｏ一 ｍｅｇａ公司，Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰｓ和各种 性内切酶均为ＴａＫａＲａ公司产品。ＤＮＡ片段快速 纯化／回收试剂盒购自北京鼎国生物技术公司，其他 试剂均为分析纯。 而Ｐ３５在许多细胞中持续低表达。到目前为止， 人、鼠等哺乳动物的ＩＬ一１ ２均已被成功克隆，最近 １．３ 载体和菌种ｐＭＤ１８一Ｔ载体为ＴａＫａＲａ公司 产品；ＪＭ１０９菌种由本实验室保存。 １．４ 引物设计 根据国外已发表的鸡ＩＬ～１２ ｃＤＮＡ 收稿日期：２００６ ０４ ０３ 作者简介：董长贵（ 。 。 ，男·硕士，从事禽类病理生理及其分 子生 。 ｏｎｇｃｈａｎｇｇ 。· 通讯作者：乔健。 ｍａｉＥ ｌ：ｑｉａｏｊｉａｎ＠ＣａＵ．ｅｄｕ．ｃｎ 基因序列设计引物，委托北京三博远志生物技术有 限责任公司合成，序列为： Ｐ３５上游引物（Ｐ１）一 …一 ：标准方差，按照公式计算阴阳性临界值，临界值等于 阴性血清０ Ｄｊ 的平均值＋３×标准方差，从而算出 阴阳性临界值。根据统计学原则，Ｏ ＞Ｘ＋３ＳＤ 时，可以判定为阳性，可作为本试验的判断标准。 经计算，阴性血清（）Ｄ 平均值为０．２２３８ｌ８， 标准差为０．０５１５６８，根据公式临界值一阴性血清平 均值＋３倍的标准差计算，临界值一０．２２３８１８＋３× ０．０５ｌ５６８—０．３７８５２２。为了判断方便，将临界值确 定为０．４。因此可以确定当待检血清样品ＯＤ ≥０．４时，可以判定为阳性，否则为阴性。 （ＥＬＩＳＡ）诊断试剂盒奠定了基础。 参考文献： Ｌ １ Ｇｕｉ Ｒｏｎｇ Ｂａｉ，Ｙｏｓｈｉｈｉｒｏ Ｓａｋｏｄａ，Ａａｒｏｎ Ｓｉｍａｎｙｅｎｇｗｅ Ｍｗｅｅｎｅ，ｅｔ ａ１．Ｅｖａｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＥＳＰＩ ＩＮＥ ＩＮＦＩ ＵＥＮＺＡ Ａ ａｎｄ Ｂ Ｋｉｔ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ａｖｉａｎ ａｎｄ Ｓｗｉｎｅ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ［Ｊ］． Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１ Ｉｍｍｕｎｏ１，２００５，４９（１２）：１０６３ １Ｏ６７． ［２］Ｄｕｎｇｗｏｒｔｈ Ｄ Ｉ ，Ｔｈｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｓｔｅｍ［Ａ］．ｅｄ．Ｊｕｂｂ ＫＦＣ， Ｋｅｎｎｅｄｙ ＰＣ．ａｎｄ Ｐａｌｍｅｒ Ｎ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｄｏｍｅｓｔｉｃ Ａｎｉｍａｌｓ ［ｃ］，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ｌ ９９３．６２４ ６２５． ￡３ｊ Ｄｉｒｅｋｓｉｎ Ｋ，Ｊｏｏ Ｈ，Ｇｏｙａｌ Ｓ Ｍ．Ａｎ ｉｍｍｕｎｏｐｅｒｏ ｘ】ｄａｓｅ ｍｏｎｏ ｌａｙｅｒ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｓｗｉｎｅ ｉｎｆｌｕ ３ 讨论 ｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ［Ｊ ．Ｊ Ｖｅｔ Ｄｉａｇｎ Ｉｎｖｅｓｔ，２００２．１４（２）：１ ６９—１７１． Ｌ４ Ｌｉａｎｇ Ｃ Ｚ，Ｃａｏ Ｒ Ｂ，Ｗｅｉ Ｊ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｅｑｕｉｎｅ ａｒｔｅｒｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ＧＬ ｐｒｏｔｅｉｎ 应用ＥＬＩＳＡ方法检测抗病毒抗体，则无需对被 检血清进行特殊处理，且具有良好的敏感性，并广泛 应用于多种动物病毒病的血清学调查中～ 。 特别是，应用重组表达的ＮＰ蛋白（ｒ—ＮＰ）作为 抗原，通过蛋白纯化及定量可以确保ＥＬＩＳＡ试验结 果的可重复性及稳定性。 本试验确定了猪流感重组ＮＰ抗原酶联免疫吸 ａｎｄ ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｉｎｄｉｒｅｃｔ Ｅｌ ＩＳＡ ａｓｓａｙ［Ｊ］． Ｗｅｉ Ｓｈｅｎｇ Ｗｕ Ｘｕｅ Ｂａｏ．２００６，４６（３）：４３６ ４４０． ［５ｊ Ａｌｔｓｔｅｉｎ Ａ Ｄ，Ｇｉｔｅｌｍａｎ Ａ Ｋ，Ｓｍｉｒｎｏｖ Ｙ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｉｍｍｕｎｉｚａ— ｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ＮＰ—ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｍｉｃｅ ａｇａｉｎｓｔ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ａ ｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ［Ｊ￣．Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ，２００６，１ ５１（５）：９２卜９３１． ［６ｊ Ｖｅｎｇｕｓｔ Ｇ，Ｖａｌｅｎｃａｋ Ｚ，Ｂｉｄｏｖｅｃ Ａ．Ａ ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｓｅ— ｌｅｃｔｅｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｉｎ ｗｉｌｄ ｂｏａｒ ｉｎ ＳｌｏｖｅｎｉａＥＪ￣．Ｊ Ｖｅｔ Ｍｅｄ Ｂ Ｉｎ— ｆｅｃｔ Ｄｉｓ Ｖｅｔ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ，２００６，５３（１）：２４ ２７． 附试验（ＥｕｓＡ）最佳工作条件及判定标准，为进一 步的研制猪流感重组ＮＰ抗原酶联免疫吸附试验 维普资讯 http://www.cqvip.com
５＇－ （ Ｃ Ｇ Ｑｃ 下游引物（Ｐ２）： ５ 一ＴＴＡＣＡＴＣＴＣＴＧＣＡＧＴＧＡＧＧＧＣＡＣ一３ ； Ｐ４０上游引物（Ｐ１）： ５＇－ＡＴＧＴＣＴＣＡＣＣＴ ＡＣ 下游引物（Ｐ２）： ５ 一ＴＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＧＣＧＴＧＧＡＣＣＡＣＴＣ一３ １．５鸡脾脏中总ＲＮＡ的提取 无菌取鸡的新鲜 脾脏，按Ｔｒｉｚｏｌ试剂盒说明书提取总ＲＮＡ。 １．６ ＲＴ—ＰＣＲ 按常规方法进行。扩增结束后各 取５ ｕＬ在１ 琼脂糖凝胶电泳检测。 １．７ ＩＬ一１２基因的克隆及鉴定Ｐ３５回收约６００多 ｂｐ的片段，Ｐ４０回收约９００多ｂｐ的片段，按ＤＮＡ 片段快速纯化／回收试剂盒说明书进行。取上述回 收的片段４．７ Ｌ，５｝上Ｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ，０．３ Ｌ ｐＭＤ１８一 Ｔ，１６℃水浴中连接过夜，然后转化Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ 感受态细胞中，并用含有氨苄青霉素的ＬＢ培养基 筛选阳性菌落，３７℃摇菌培养过夜，用碱裂解法［３ 小 量提取质粒。将消化后的质粒用ＥｆｏＲ工／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ 双酶切进行鉴定。 １．８ ＩＬ一１２序列的测定 各选２株阳性克隆菌落， 由北京奥科公司分别进行双向测序。 ２ 结果 ２．１ ＩＬ一１２基因扩增的结果 根据ＧｅｎＢａｎｋ上已 发表的序列，设计两对特异性引物，再应用Ｒ ＰＣＲ 技术扩增得到了与预计长度相吻合（Ｐ４０ ｃＤＮＡ为 ９４８ ｂｐ，Ｐ３５ ｃＤＮＡ则为６１８ ｂｐ）的目的片段，见图１。 ７５０ ｂｐ ２ ０００ ｂｐ ５（）（）ｂｐ ｌ ０００ ｂｐ 图１ ＩＬ－１２基因的扩增 １．Ｐ３５；２．Ｐ３５阴性对照；３．Ｍａｒｋｅｒ（ＤＬ－２ ０００） ４．Ｐ４０阴性对照；５．Ｐ４０ ２．２重组质粒的鉴定将ＰＣＲ产物经回收纯化后 与质粒ｐＭＤ１８－Ｔ连接，筛选出阳性克隆后经ＥｃｏＲ 工／ＨｉｎｄⅢ对重组质粒双酶切，得到与预期大小相 同的目的条带，见图２。 ２．３序列测定 用末端双脱氧链终止法对鉴定为 阳性的两个克隆分别进行核苷酸双向测序。与已发 表的鸡Ｉ １２ ｃＤＮＡ序列（ＡＹ２６２７５２和ＡＹ２６２７５１） 相比，Ｐ４０序列编码区第６５４、８７６位核苷酸分别由 Ｃ、Ｔ突变为Ｔ、Ｃ，这两处突变是无义突变，因此氨基 酸的同源性为１００ ；Ｐ３５序列编码区的核苷酸没有 中国兽医杂志２００７年（第４３卷）第１Ｏ期 ２３ 发生突变。Ｐ４０序列已被ＧｅｎＢａｎｋ接受，登陆号为 ＤＱ２Ｏ２３２８。 ２０００ ｂｐ ｌ ０００ ｂｐ ７５０ｂｐ ５００ ｂｐ 图２重组质粒鉴定 １．Ｍａｒｋｅｒ（ＤＬ一２ ０００）；２．Ｐ４０用ＥｃｏＲ Ｉ／ＨｉｎｄⅢ进行酶切 ３．Ｐ３５用ＥｃｏＲ Ｉ／ＨｉｎｄⅢ进行酶切 ３讨论 ＩＬ一１２是一种能有效调节机体免疫应答的细胞 因子，它可以通过多种免疫细胞、免疫细胞膜分子、 细胞因子构成的免疫调节网络，在增强细胞免疫和 调节免疫应答类型中发挥了重要作用。在临床实践 中特别是在抗肿瘤免疫和自身免疫疾病的治疗中具 有广泛的应用前景。近年来有研究表明ＩＬ一１２作为 种佐剂，可增强基因疫苗的免疫应答作用 ］。但 对于禽类ＩＬ一１２的研究则起步较晚，２００４年Ｄｅｇｅｎ ｗ．Ｇ．Ｊ．等首次克隆到鸡ＩＬ一１２基因，国内则尚未见 到有关鸡ＩＬ一１２基因研究的报道。 本研究从感染大肠杆菌的病鸡脾脏中利用ＲＴ— ＰＣＲ方法成功地克隆出Ｐ４０和Ｐ３５ ｃＤＮＡ，测序结果 表明，本研究克隆的Ｐ３５ ｃＤＮＡ序列与已在ＧｅｎＢａｎｋ 登录的Ｐ３５ ｃＤＮＡ序列完全一致，而Ｐ４０ ｃＤＮＡ序 列却与登录在ＧｅｎＢａｎｋ的２个Ｐ４０ ｃＤＮＡ序列分 别有２处碱基不同，但其编码的氨基酸序列却完全 致。因此，本研究对于鸡ＩＬ一１２基因的克隆，可为 进一步表达鸡ＩＬ一１２并深入研究其功能奠定了基 础，后续工作有待于进一步研究。 参考文献： ［１］Ｍ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ…Ｉ Ｆｉｔｚ，Ｍ．Ｒｙａｎ，ｅｔ ａ１．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ（ＮＫＳＦ），ａ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ＥＪ］．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ，１９８９，１ ７０：８２７—８４５． ［２］Ｕ．Ｇｕｂｌｅｒ，Ａ．Ｏ．Ｃｈｕａ，Ｄ．Ｓ．Ｓｃｈｏｅｎｈａｕｔ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｅｘｐｒｅｓ— ｓｉｏｎ ｏｆ ｔＷＯ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｇｅｎｅｓ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｂｉｏ— ａｃｔｉｖｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒＥＪ］．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９１，８８：４１４３—４１４７． ［３３唐琼，王伯瑶．１Ｌ一１２表达调节的研究进展［Ｊ］．四川生理科学杂 志，２００２，２４（４）：１５６～１５９． ［４］Ｄｅｇｅｎ Ｗ Ｇ Ｊ，Ｖａｎ ＤａＭ Ｎ，Ｖａｎ Ｚｕｉｌｅｋｏｍ Ｈ １，ｅｔａ１．Ｉｄｅｎｔｉｆｉ— ｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｃｋｅｎ ＩＬ一１２［Ｊ］． Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００４，１７２（７）：４３７卜４３８０． ［５］Ｊ．萨姆布鲁克，Ｄ．Ｗ．拉塞尔．分子克隆实验指南［ｅ１．３版． 北京：科学出版社，２００２． ［６］ 倪兵，吴玉章，王莉，等．ＩＩ 一１２对小鼠肥大细胞瘤基因疫苗的 免疫学作用ｒＪ］．免疫学杂志，２００２，７，４（１８）：１３９—１４３．
