食品科学 现代农业科技２０１０年第２２期 食品中单核细胞增生李斯特氏菌快速检测方法的建立 ． 刘书花李福伟李剑张瑞凌 （山东省分析测试中心山东省大型精密仪器应用技术重点实验室，山东济南２５００１４） 摘要建立了食品中单核细胞增生李斯特氏茵快速、敏感、特异的ＰＣＲ快速检测方法。选取ｈｌｙＡ基因作为靶序列设计ｌ对引物。在单 核细胞增生李斯特氏茵中能扩增出３５６ ｂｐ的预期片段，大肠杆茵、沙ｆ＇ｌ氏茵、葡萄球茵的扩增结果均为阴性．表现出极好的单增李斯特茵 种特异性。纯培养的检测极限为４６个细菌。用该方法对３６份食品样品进行检测，检测结果与分离鉴定方法完全相符，表明该方法可适用 于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测。 关键词食品：单核细胞增生李斯特氏菌：ＰＣＲ快速检测方法 中图分类号ＴＳ２０７．５ 文献标识码Ａ 文章编号１００７—５７３９（２０１０）２２—０３５２—０２ 单核细胞增生李斯特氏菌（Ｌｉｓｔｅｉｅ ｍ￣ｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ，简称 Ｌ．Ｍ，单增李氏菌），是一种人畜共患病病原菌＿１ｌ，使人和动物 患脑膜炎、脑炎、败血症及造成怀孕妇女流产、死胎等疾病。 该菌可通过眼睛及破损的皮肤、粘膜进入体内而造成感染， 孕妇感染后通过胎盘或产道感染胎儿或新生儿，栖居于阴道、 子宫颈的该菌也会引起感染。单增李斯特氏菌不易被冻融， 能耐受较高的渗透压，在土壤、地表水、污水、植物、青贮饲养 中均有该菌存在．所以动物很容易食入该菌，并通过口腔一 粪便的途径进行传播。据报道，健康人粪便中单增李斯特氏 菌的携带率０．６％～１６．０％，有７０％的人可短期带菌，４．０％～ ８．０％的水产品、５．０％～１０．０％的奶及其产品、３０．０％以上的肉 制品及１５．０％以上的家禽均被该菌污染。人主要通过食入软 奶酷、未充分加热的鸡肉、鲜牛奶、冻猪舌等而感染，约占 ８５％～９０％的病例是由被污染的食品引起的。近年来，国外 报道该菌所致的食物中毒越来越多，病死率高达３０％～７０％ 【２＿引。国内也不断有散发病例，引起ｊ，国内医学界的普遍关注。 ＷＨＯ在２０世纪９０年代已将其列为食品四大致病菌之一 。该菌在自然界分布广泛，以家畜、家禽兽为主要宿主，易 污染食品而引起食物中毒和李斯特病暴发［６－７］。 食品是导致人类受单核细胞增生李斯特氏菌感染的主 要传播途径，由于该菌在４℃冰箱保存的食物中仍可生长 繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。在绝大 多数食品中都能找到李斯特氏菌，肉类、蛋类、禽类、海产 品、乳制品、蔬菜等都已被证实是李斯特氏菌的感染源阎。随 着我国冷藏、速冻食品消费量的迅速增多，食品中单增李斯 特氏菌的潜在危险性也越来越突出，因此，在食品卫生微 生物检验中必须加以重视。单增李斯特氏菌在一般热加工 处理中能存活，热处理已杀灭了竞争性菌群，使单增李斯特 氏菌在没有竞争的环境条件下易于存活，则在食品加工中， 中心温度必须达到７０℃持续２ ｍｉｎ以上。单增李斯特氏菌 在自然界中广泛存在，即使产品已经过热加工处理充分杀 灭了李斯特氏菌．但有可能造成产品的二次污染。因此， 蒸煮后防治二次污染是极为重要的。目前，国内流行的对单 增李氏菌的检测方法为传统培养法，主要是按照国家标准 ＧＢ４７８９．３０—２０１０，该方法检测周期冗长，准备工作繁琐，耗 基金项目 山东省科学院科技发展计划项目。 作者简介 刘书花（１９８０一），女，山东德州人，助理研究员，博士，从事微 生物分子生物学研究工作。 收稿日期 ２０１０－０９—１７ ３５２ 时耗力。因此，该试验针对这一状况，拟在建立食品中单核 细胞增生李斯特氏菌快速、敏感、特异的ＰＣＲ快速检测方 法，并将这一检测方法应用于食品样品的检测，检测结果与 传统方法完全相符。 １材料与方法 １．１试验材料 Ｌ１．１菌种。单核细胞增生李斯特氏菌、大肠杆菌、金黄色 葡萄球菌、沙门氏菌菌种均购自山东省疾病预防控制中心， 接种到营养肉汤中制成标准菌液，３６℃增菌培养。 １．１．２检测样品。从济南市各超市及农贸市场购齐３６份食 品样品。分别为生猪肉、生鸡肉、袋装新鲜牛奶、烤肠、酱肉 等几类。将这些样品分别用新建ＰＣＲ方法和传统培养法进 行检测．并对检测结果进行比较。 １．１．３核酸ＤＮＡ制备。细菌基因组的提取使用的是天根生 化科技（北京）有限公司的细菌基因组ＤＮＡ提取试剂盒，操 作步骤按照提取试剂盒说明进行。 １．２主要试剂及溶液的配置 ＰＣＲ反应试剂盒为大连宝生物工程有限公司生产的 ＴａＫａＲａ产品，细菌培养用显色培养基为法国科玛嘉（郑州 博赛生物技术研究所）产品，增菌培养基为北京陆桥生物技 术有限公司生产。 １．３主要仪器设备 Ｂａｓｉｃ Ｐａｎｏｒａｍｉｃ型均质器（西班牙ＩＵＬ），ＤｅｌｔａＤｉｌｕｔｏｒ型 精密电子稀释器（西班牙ＩＵＬ），Ｓ１０００ＴＭ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＣＲ 反应仪（美国ＢｉｏＲａｄ公司），ＤＹＣＺ一２０Ａ型ＤＮＡ序列分析电 泳仪（北京市六一仪器厂）。 １．４试验方法 １．４．１ ＰＣＲ引物的设计与合成。从ＧｅｎＢａｎｋ中获取各种不 同来源地ＬＭ的一ｈｌｙＡ基因序列，应用ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓ软件分 析基因序列，根据引物设计原则，在这些序列的保守区域筛 选到能扩增目标片段长度为３２９ ｂｐ的１对引物，委托北京 博尚生物有限公司合成，其序列如下：上游引物为５’一ＴＧＴＣ ＴＣＡＧＧＴＧＡＴＧＴＡＧＡ一３’：下游引物为５’一ＴＣＧＴｒＡＣＣＴＹＣＡＧ ＧＡＴＣＡ一３’。 １．４．２ ＰＣＲ反应体系与条件。进行ＰＣＲ扩增ＰＣＲ反应体系 为：模板ＤＮＡ １．０ ＩｘＬ、１０ Ｉ￣ｍｏＬ／Ｌ上下游引物各０．５ Ｌ、２ ｍｍｏＬ／Ｌ ｄＮＴＰ ２．０ Ｌ、２．５ Ｕ／ＩｘＬ Ｙａｑ酶０．２ Ｌ、２５ ｍｍｏＬ／Ｌ Ｍｇ２ ２．０ Ｌ、１０倍缓冲液２．０ Ｌ、补ＤＥＰＣ水至２５ Ｌ。循环 刘书花等：食品中单核细胞增生李斯特氏菌快速检测方法的建立 参数为：预变性９５℃，５ ａｉｒｎ；变性９５℃，５０ Ｓ；退火５６℃，５０ Ｓ；延长７２ ｏＣ，３０ Ｓ；３０个循环；再延长７２℃，１０ ｍｉｎ。产物鉴 定：扩增产物于１．５％琼脂糖凝胶上电泳，经ＥＢ染色后，紫 外灯下观察。 ２结果与分析 ２．１新建ＰＣＲ检测方法的特异性 设计的ＰＣＲ反应应具有能从复杂样品中特异性地扩增 目标片段的能力，因此选择合适的用于扩增检测的基因是 保证检测方法特异性的关键。试验选择了单增李氏菌的 ｈｌｙＡ基因，扩增片段为３５６ｂｐ，具有良好的种特异性。将单 增李氏菌标准菌株及金黄色葡萄球菌等４种相关细菌进行 检测，电泳图谱如图１所示。新建方法除单增李氏菌出现明 显条带外，其他菌株均不见扩增条带。表明该试验建立的 ＰＣＲ检测方法对单增李氏菌具有很好的特异性，与其他相 关肠道细菌无交叉反应。 ５ｏｏ ２５０ １ ２ ３’４ ５ ６ 图ｌ单增李氏菌特异性扩增条带电泳结果 注：Ｌｉｎｅ １为ＤＮＡｍ ａｒｋｅｒ；Ｌｉｎｅ ２～３为单核李氏菌：Ｌｉｎｅ４为金黄 色葡萄球菌；Ｌｉｎｅ ５为沙Ｉ、－３氏菌；Ｌｉｎｅ６为大肠杆菌。 ２．２新建ＰＣＲ检测方法的灵敏性 以无菌操作将单增李氏菌标准菌种的纯培养液充分混 匀，按１０倍递增稀释至１０一～１Ｏ－Ｓ浓度，然后分别取ｌ０。～ｌ０－ｓ 各不同梯度稀释液提取核酸ＤＮＡ，按新建ＰＣＲ方法进行单 增李氏菌检测，电泳结果如图２所示。从图２可以看出， 最低可以检测的菌液的稀释数量级是１０ 倍。另外，分别将 ｌ 一１０≈这４个浓度的纯培养液各取０．１ｍＬ，划线接种单增 李氏菌科马嘉选择性平板，培养后计数菌落数目。通过计算 可知单增李氏菌标准菌种纯培养液中细菌浓度为４．６ｘ１０ｓ ｃｆｕ／ｍＬ。由此可知，纯培养的检测极限为４６个细菌浓度。 ２．３食品中单增李畏葛ＰＣＲ检测方法的建立 将市面上购买来的３６种样品，经单增李氏菌增菌液增 菌培养后，选择３种样品人工感染单增李氏菌，检测过程分 别采用新建ＰＣＲ方法和传统培养法进行平行试验．将２种 检测方法进行比较，进而评价该新建ＰＣＲ方法。试验结果表 明，对于已知感染单增李氏菌的样品．２种检测方法均检测 为阳性，对剩余３３种样品，新建ＰＣＲ方法检测有１份为单 增李氏菌阳性，传统培养法也检出该样品为单增李氏菌 阳性。２种检测方法检测阳性样品结果完全一致，符合率为 １００％。该试验过程利用传统培养法检测对新建ＰＣＲ方法进 行鉴定，通过对实际样品的检测，表明该方法对于单增李氏 ５ｏ０ ２５０ 图２单增李氏菌不同基因组ＤＮＡ浓度的特 异性扩增条带电泳结果 注：Ｌｉｎｅ １为ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ；Ｌｉｎｅ ２为１Ｏ。浓度基因组ＤＮＡ；Ｌｉｎｅ ３ 为１０ 浓度基因组ＤＮＡ：Ｌｉｎｅ ４为１０ 浓度基因组ＤＮＡ；ｉＬｎｅ ５为１ 浓度基因组ＤＮＡ；Ｌｉｎｅ６为１ 浓度基因组ＤＮＡ。 菌阳性样品未存在漏检，同时对于阴性样品也未出现假阳 性结果，说明该新建ＰＣＲ方法检测特异性较高。 ３结论与讨论 单增李氏菌是是一种人畜共患病病原菌，使人和动物 患脑膜炎、脑炎、败血症及造成怀孕妇女流产、死胎等疾病。 因此，为有效地预防和控制食品传播疾病。建立快速、敏感 及特异地检测食品中单增李氏菌的方法非常必要。传统培 养法对单增李氏菌的检测，需经过增菌培养后再进行分离 培养，然后将分离培养后的菌落进行多种生化试验、溶血试 验、动物试验及动力试验等多步表型检测方法，过程繁琐、 费时费力。因此，传统培养法在快速、敏感与特异性等方面 具有自身的局限性。 该试验过程利用新建ＰＣＲ方法对实际样品进行检测。 通过与传统培养法检测结果进行比较，该新建ＰＣＲ方法对 已知被单增李氏菌污染的样品都能检测出来，对未知污染 状况的样品进行检测，发现有１个样品被单增李氏菌污染， 表明该方法对于单增李氏菌阳性样品未存在漏检；同时对 于阴性样品也未出现假阳性结果，说明该新建ＰＣＲ方法检 测特异性较高，适用于食品中单增李氏菌的检测，灵敏度 高，结果准确。 ４参考文献 ［１】ＮＡＫＡＭＡ Ａ，ＭＡＴＳＵＤＡ Ｍ，ＩＴＯＨ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｅｙｔｏｇｅｎｅｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｉｎ Ｊａｐａｎ ｂｙ ｐｕｌｓｅｄ—ｆｉｅｌｄ ｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ【Ｊ】．Ｊ Ｖｅｔ Ｍｅｄ Ｓｃｉ，１９９８，６０（６）：７４９—７５２． 【２］ＫＥＲＲ Ｋ Ｇ，ＬＡＯＥＹ—ＬＩＳＴＥＲＩＯＳＩＳ Ｒ Ｗ．Ｎｅｗ ｐｒｏｂｌｅｍｓ ｗｉｔｈ ａｌｌ ｏｌｄ ｐａｔｈｏｇｅｎ［Ｊ］．ＪｏｆＨｏｓｐｉｔａｌＩｎｆｅｎｔｉｏｎ，ｉ９８８（１２）：２４７． 【３】沈晓盛，郑国兴，李庆，等．食品中单核细胞增生李斯特菌的危害及其 检测［Ｊ１．食品与发酵工业２００４．３０（８）：８７—９１． 【４］ＲＹＳＥＲ Ｔ，ＥＬＭＥＲ Ｈ Ｍ．Ｌｉｓｔｅｒｉｏｓｉｓ ａｎｄ ｆｏｏｄ ｓａｔｉａｙ［Ｊ］．Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｉｎｅ， １９９１，６（２）：２１４． ｆ５】徐德顺，吴晓芳，程平庆，实时荧光定量ＰＣＲ法与常规ＰＣＲ法及细 菌培养法检测单增李斯特菌的比较叨．中国卫生检验杂志，２００７，ｌ７ （５）：８６１—８６３． ［６］寇运同，马洪明，刘晨光．用ＰＣＲ技术快速检测食品中的单核细胞增 生性李斯特氏菌明．食品科学，２００１，２２（５）：５２—５５． 【７】肖义泽，任丽娟．云南省首次动物源性李斯特氏菌病暴发的流行病学 调查叨．中华流行病学杂志，２０００，２１（３）：２３６． 【８］袁宝民．食品微生物学及其检验［Ｍ］．沈阳：东北大学出版社，ｌ９９３：９６． ３５３
