胍丁胺对糖尿病神经病理性疼痛大鼠的干预效应及机制

刘星3,张珍祯，陈春林，马浩(宜春学院，江西宜春336000)摘要：目的 观察呱丁胺(AGM)对糖尿病神经病理性疼痛(DNP)模型大鼠的干预效应，并探讨其可能的机制。 方法 将40只雄性SD大鼠随机分为5组各8只，除对照组外其余各组单次腹腔注射链服佐菌素65 mg/kg构建

糖尿病模型;足底触痛仪测量糖尿病大鼠机械缩足阈值(MWT)和热缩足潜伏期(TWL),降幅〉20%基础阈值视为

DNP大鼠模型制备成功。AGM-150组、AGM-300组、GP组分别腹腔注射AGM 150,300 mg/kg和加巴喷丁 100 mg/

kg,对照组、模型组腹腔注射等量生理盐水。分别于STZ注射前1 d(0d)STZ注射后7、14、21、28 d,取尾静脉血检

测血糖，足底触痛仪测量MWT、TWL；检查后处死大鼠取脊髓组织，采用Western blotting法检测磷酸化细胞外调节

蛋白激酶(p-ERK)活性。结果 与对照组比较，其他各组血糖均升高，MWT降低、TWL缩短(P均<0.01 )。与模

型组比较,AGM-150组、AGM-300组于STZ注射后21,28 d血糖降低(P <0.05或< 0.01) GP组血糖差异无统计学 意义；AGM-150 组、AGM-300 组 MWT(21、28 d)升高、TWL(28 d)延长(P 均 <0.01 )GP 组 21,28 d 时 MWT 升高、 TWL延长(P <0.05或<0.01)于STZ注射后28 d,模型组p-ERK蛋白表达量高于对照组(P <0. 05) AGM-150

组、AGM-300组、GP组大鼠脊髓p-ERK表达量均低于模型组(P <0. 05或<0.01)。结论 AGM具有明显地调节

血糖及镇痛效应，其镇痛机制可能与其对血糖的调节及抑制脊髓ERK蛋白的活化有关。关键词:糖尿病神经病理性疼痛;呱丁胺;加巴喷丁;血糖;镇痛作用;细胞外调节蛋白激酶;大鼠

doi： 10. 3969/j. issn. 1002-266X. 2019.14. 010中图分类号:R587.1 文献标志码:A 文章编号：1002-266X(2019) 14-0039-04Effect of agmatine on diabetic neuropathic pain rats and its mechanismLIU Xingyu, ZHANG Zhenyu, CHEN Chunlin, MA Hao(Yichun College, Yichun 336000 , China )Abstract: Objective To investigate the intervention effect of agmatine (AGM) on diabetic neuropathic pain (DNP)

rats and its mechanism. Methods Forty male SD rats were randomly divided into five groups (n =8). Except the control

group, the diabetes models were established by single intraperitoneal injection of streptozotocin 65 mg/kg in the other groups. Mechanical withdrawal threshold (MWT) and thermal withdrawal latency (TWL) in the diabetic rats were measured by plan­

tar tenderness meter. A reduction of > 20% basal pain threshold was considered successful in the preparation of the DNP rat

model. Rats in the AGM-150 group, AGM-300 group and gabapentin ( GP) group were intraperitoneally injected with AGM

150, 300 mg/kg and GP 100 mg/kg. The rats in the control group and the model group were intraperitoneally injected with

the same amount of normal saline. MWT, TWL and blood glucose was detected at 1 d before operation, and 7, 14, 21 , 28 d

after STZ injection. The expression of phosphorylation of extracellular regulated protein kinase ( p-ERK) was detected by

Western blotting. Results Compared with the control group, the blood glucose of the other groups increased, and the MWT and TWL decreased (all P < 0. 01 ) . Compared with the model group, the blood glucose of the AGM-150 group and AGM-300

group decreased at 21 and 28 d after STZ injection (P < 0. 05 or P < 0. 01 ) . There was no statistically significant difference in

blood glucose between the GP group and the model group. MWT and TWL in the AGM-150 group, AGM-300 group and GP group increased (P <0. 05 or P <0. 01). The expression of p-ERK protein in the model group was higher than that in the

control group ( P <0.05). The expression of p-ERK of the AGM-150 group, AGM-300 group and GP group was lower than

that of the model group at 28 d after STZ injection (P < 0. 05 or P < 0. 01 ) . Conclusion AGM may significantly regulate

blood glucose and ease pain via depressing the expression of the activation of ERK protein in the spinal cord.基金项目：江西省教育厅科学技术研究青年基金项目(GJJ161041) 通信作者：马浩(E-mail： promisingmh@163.com)39山东医药2019年第59卷第14期Key words: diabetic neuropathic pain ； agmatine ； gabapentin ； blood glucose ； analgesic effect ； extracellular regulated

protein kinase；rats糖尿病神经病理性疼痛（DNP）是指由糖尿病诱

发的外周及中枢神经病变所致的顽固性疼痛,严重影 响患者的生活质量。目前DNP治疗药物主要有醛糖

mg/kg；于注射后72 h,测量尾静脉空腹血糖，随机

血糖浓度M16.7 mmol/L且稳定认为制备糖尿病大

鼠模型成功。于注射14 d后,测定糖尿病大鼠机械 缩足阈值（MWT）、热缩足潜伏期（TWL）,降低幅度

还原酶抑制剂、血管扩张剂、神经营养剂、自由基清除 剂等,临床应用结果显示以上药物对患者肢端麻木的 改善效果较好，但对减轻疼痛效果不明显。作为二线

治疗的阿片类药物或非笛体类抗炎药，虽然具有良好

> 20%基础阈值视为DNP模型制备成功。1.2.2动物分组及药物干预 取32只DNP模型

大鼠，采用随机数字表法分为4组各8只。注射

的镇痛活性，但多伴有较严重的不良反应并易导致严

重的躯体或心理依赖。因此,DNP的治疗已成为世界 疼痛领域面临的一大难题，寻找新的安全有效的治疗

药物迫在眉睫。孤丁胺（AGM）是精氨酸在左旋精氨 酸脱竣酶（L-ADC）催化下脱竣基而成的一种内源性 生物活性物质,对炎性疼痛或慢性神经源性疼痛都有

一定的镇痛效应。然而，有关AGM治疗DNP的效果

及作用机制的报道鲜见。2018年3 ~8月，我们采用

链服佐菌素（STZ）构建DNP大鼠模型畐以经典神经病 理性疼痛治疗药加巴喷丁（ GP）为阳性对照,通过观 察其行为学和脊髓组织中磷酸化细胞外调节蛋白激 酶（p-ERK）表达变化，探索AGM的镇痛机制，旨在为 DNP的临床治疗提供安全有效的新型治疗药物奠定

理论支持。1材料与方法1.1主要材料SPF级SD雄性大鼠,体质量180 ~200 g,由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提

供,动物许可证号SCXK（湘）2016-0002,所有操作

符合动物伦理委员会的要求。STZ（批号S0130）、 AGM（批号A7127）均购自美国Sigma公司，加巴喷

丁（批号G122413）购自上海阿拉丁生化科技股份有

限公司;ERK1/2及p-ERK1/2兔抗大鼠多克隆抗体

购自南京巴傲得生物科技有限公司,辣根过氧化物 酶标记的羊抗兔二抗购自武汉博士德公司，蛋白提

取试剂盒、ECL增强化学发光试剂盒和BCA蛋白定 量检测试剂盒均购自美国Thermo公司;Imark酶标

仪、Trans-Blot1703920蛋白电泳仪均购自美国Bio­Rad 公司,Alpha Imager HP凝胶成像系统购自美国 Alpha公司，YLS-22A型足底触痛仪购自北京众实

迪创科技发展有限责任公司。1.2实验方法1.2.1

DNP模型构建大鼠在自然光线，自由摄

食、饮水条件下适应性喂养7 do进行基础阈值检 测，剔除先天对痛觉不敏感的大鼠。大鼠夜间禁食

不禁水12 h后，单次腹腔注射新鲜配制STZ溶液65 40STZ后第15天起,AGM-150、AGM-300组分别腹腔

注射 AGM 150,300 mg/kg, GP 组腹腔注射 GP 100 mg/kg,模型组腹腔注射等量生理盐水;另取8只正

常小鼠作为对照组，腹腔注射等量生理盐水。各组

均腹腔注射1次/d,连续14 do1.2.3大鼠血糖测定 分别于STZ注射前1d（0 d） ,TZ注射后7、14、21、28 d,取尾静脉血,用三诺

稳 血糖仪测定 血糖。1.2.4大鼠疼痛行为学检查 分别于STZ注射前 1 d（0 d）,STZ 注射后 7、14、21、28 d,测量 MWT 和 TWL等疼痛行为学指标，测定时间均于每日9：00 -

16 ：00完成。维持室温25 左右，将大鼠置于足底

触痛仪实验箱中适应30 min后即可开始进行测量。 按照激光定位大鼠后肢足底掌心,视频屏幕协助定

位;用足底触痛仪记录底部针头或热触头从上升至 接触大鼠足底到引起大鼠足部挪开刺激位置的力

（即为MWT）或时间（即为TWL）,读数精确至0.1

N或0.1 s；重复3次，取平均值作为统计数据，每次

测量间隔时间不少于3 min。为避免损伤动物，选取

的最大测试压力为55 N、触发温度为35七。1.2. 5 大鼠脊髓组织p-ERK蛋白检测 采用

Western blotting法。行为学检查后，冰上迅速断头

处死大鼠，快速剪取脊髓L4 ~ L6节段;加入细胞裂

解液后置于匀浆器中充分匀浆，冰上裂解30 min后

转至1.5 mL离心管;4 °C下以12 000 r/min离心15

min,取上清液。BCA法测定样本蛋白浓度后，按

1: 4加入5 X上样缓冲液，煮沸变性5 min后-20 C

保存。将样本蛋白在10% SDS-PGE凝胶系统中上 样电泳，采用浓缩胶电压80 V,分离胶电压120 V电

泳。电泳完成后裁取所需分子量的凝胶，湿转法将

目的蛋白转移至PVDF膜上,5%脱脂牛奶封闭1 h；

加入兔源p-ERK 一抗（1：1 000 ）,4 C孵育过夜，洗

涤液漂洗滤膜3次，每次10 min；加入辣根过氧化物

酶标记山羊抗兔二抗（1：5 000）室温摇床孵育1 h, Washing Buffer 3

, 10 min。 凝胶成像仪

山东医药2019年第59卷第14期曝光成像，用Image J图像分析软件对目标条带进行

软件。计量资料以x± s表示,多组间比较行单因素 方差分析(One Way ANOVA)。P <0.05为差异具。测定。曝光结束后，膜再生液洗脱p-ERK抗体;将

PVDF膜与兔源ERK( 1：1 000) 一抗孵育,再按前述

方法操作后曝光成像。以p-ERK与总ERK蛋白条 带灰度值的比值来表示p-ERK的表达变化水平。1.3 统计学方法 采用Graphpad Prism 6. 0统计2 结果2.1各组大鼠血糖水平比较 见表1o2.2 各组大鼠MWT、TWL比较 见表2、表3。表1 各组大鼠血糖水平比较(mmol/L,x ±s)纽力AGM-150 组AGM-300 组GP 组888880d7d14 d21.39±0.47a21.54±0.67a20.39 ±0.44a22.33 ±1.04a4. 60 ± 0. 68

21 d28 d组对照组4.77 ±0.676.34 ±0.755.26±1.015.39±0.596.17 ±0.5420.61 ±0.55a20.29 ±0.a21.49±0.56a20.00 ±0.52a4. 66 ± 0. 4817.01 ±0.70ab17.50±1.04ab18.33 ±0.44a20.59 ±0.88a5.51 ±0.5416.67±16.67ac15.13 ±0.59ac19.43 ±0.55a21.37±0.a3.90 ±0.61注:与对照组比较加P <0.01；与模型组比较加P <0.05抑P <0.01oMWT表2各组大鼠MWT比较(N, ±s)纽力AGM-150 组AGM-300 组GP 组888880d7d14 d21 d28 d组对照组27.33 ±1.2328. 74 ± 0. 9527.97 ±1.1530.07 ±1.3228.19 ±0.7621.40±0.35a22.79 ±0.52a22.03 ±0.50a22.77 ±0.3a26.73 ±0.2617.00±0.42a17.79±0.69a18.51 ±0.35a17.40±0.29a27.07±0.3320.17 ±0.37ac21.36 ±0.19ac20.70 ±0.39ac17.51 ±0.25a24. 61 ± 0. 4320.77 ±0.59ac23.07 ±0.36ac23.29 ±0.51a17.54±0.17a25.40 ±0.42注与对照组比较a P <0.01与模型组比较c P <0.01:,；,oTWL表3各组大鼠TWL比较(s,x± s)纽力AGM-150 组AGM-300 组GP 组888880d7d14 d21 d28 d组对照组17.50 ±0.8317.77±0.6016.49±0.4417.19±0.3517.27±0.7512.±0.34a12.93 ±0.27a13.13 ±0.24a12.83 ±0.39a16.34±0.2711.47±0.32a11.21 ±0.26a11.31 ±0.34a11.31 ±0.34a15.61 ±0.3411.97 ±0.36a12.61 ±0.60a12.90 ±0.26ab11.27 ±0.25a16.57±0.3912.29±0.32a13.09±0.48ac12.93 ±0.30ac11.23 ±0.27a16.24 ±0.36注:与对照组比较,a P <0.01；与模型组比较,b P <0.05,c P <0.01

2.3各组大鼠脊髓p-ERK表达比较 与对照组大 阈值，证明DNP大鼠模型制备成功。AGM是咪卩坐咻受体的内源性配体，作为一种新

鼠脊髓p-ERK表达量(2 460.55 ±110.41)比较，模 型组p-ERK蛋白表达量(4 431.22 ±434.78)增加

(P <0.05)与模型组比较,AGM-150 组(2 422. 35

的神经递质/调质，参与多种疾病的病理过程，具有

神经细胞保护、镇痛，促细胞增殖，预防和治疗阿片 所致躯体、精神依赖和复吸等重要药理作用，有良好

±145.42)、AGM-300 组(3 375.4 ±304. 38)、GP 组 (2 761.19 ±337.71、大鼠脊髓p-ERK表达量均降

的开发前景及应用价值。内源性AGM可能通过激

活功能性咪卩坐咻受体Nischarin蛋白参与中枢神经 系统阿片功能的调节来产生镇痛效应⑶。在大鼠 醋酸扭体实验中，外源性给予AGM可以观察到明 显的镇痛活性⑷。兰忠平等⑹采用蜜蜂毒新型炎 性痛模型,鞘内同时注射AGM与吗啡可发挥协同

低(P <0.05 或< 0.01 )o3讨论DNP的发病机制十分复杂，目前尚缺乏确切的

病因学解释。约87%的糖尿病患者长期承受着神

经病变所致的慢性疼痛，治疗上主要依赖于改善患 者血糖水平及促进外周神经损伤的修复⑴。由于

镇痛作用。坐骨神经结扎大鼠海马内注射AGM(1 ~10 Rg)，可剂量依赖性地减轻其神经病理性疼痛,

疼痛是一种不愉快的主观情感体验，只能将疼痛阈

值作为疼痛的评估标准。研究表明，腹腔注射STZ 可引起机械痛觉过敏和触觉异常性疼痛⑵。本研

可能与海马b受体调节肿瘤坏死因子a(TNF-a)表 达减少有关［6］。本研究结果表明,AGM (150、300

mg/kg)能显著提高DNP大鼠的MWT、延长TWL,

究采用单次腹腔注射STZ 65 mg/kg制备糖尿病大

鼠模型，利用MWT、TWL作为疼痛指标，造模后大 鼠MWT、TWL均明显下降，且降低幅度> 20%基础

且AGM 300 mg/kg作用效果与GP相当，证明AGM

能减轻糖尿病大鼠神经病理性疼痛。本研究中

41山东医药2019年第59卷第14期AGM对DNP大鼠TWL的延长效果没有MWT增高

AGM 具 节血糖及镇痛 , 其镇痛的明显，可能与仪器探头接触大鼠足部肉垫有关。 除了对大鼠行为学上的影响，本研究发现AGM

(150、300 mg/kg)均可降低DNP大鼠血糖水平，与 Molderings等⑺的研究结论一致。Li等⑹研究发

与其对血糖的 节及 脊 ERK 蛋白的化有关，为其临床应用奠定了一定的理论基础。 参考文献：[1] Schreiber AK, Nones CF, Reis RC, et al. Diabetic neuropathic

现，在细胞水平上,AGM对STZ诱导的胰岛0细胞

损伤具有抑制作用,可能与其激活咪卩坐咻受体I3亚

pain: physiopathology and treatment] J]. World J Diabetes, 2015 , 6(3)：32-44.[2] Malcangio M, Tomlinson DR. A pharmacologic analysis of mechan­

ical hyperalgesia in streptozotocin/diabetic rats [ J ]. Pain, 1998 , 76(1-2)：151-157.型有关。这提示AGM可能通过激活咪卩坐咻受体, 降低血糖水平来延缓DNP进程，改善DNP症状。ERK家族有5个亚族，其中ERK1/2通过级联

[3 ] Li F, Wu N , Su R, et al. Imidazoline receptor antisera-selected/

Nischarin regulates the effect of agmatine on the development of

信号将细胞外刺激传递至细胞核、磷酸化转录因子,

可调节细胞功能,参与细胞增殖、分化、存活、死亡等

神经细胞重要功能的，在疼痛及痛觉过敏信号

传导过程中起重要作用。ERK1/2的磷酸化含量可

反映多种刺激诱发的神经细胞的快速变化，是一种新

型神经细胞活动的功能指标［9］。在多种病理性疼痛

模型中，均发现ERK信号通路参与了脊髓水平伤害

性信号调节和中枢敏感化的形成［10>11］。伤害性刺激

使脊髓背角或背根神经节神经细胞ERK发生磷酸

化，磷酸化的ERK 一方面通过磷酸化神经细胞膜离

子通道或受体，调节神经细胞的兴奋性;另一方面激

活核内转录因子调节伤害性刺激引起的靶基因表达, 介导疼痛及痛觉敏化信号转导。Han等［12］研究发

现，在大鼠坐骨神经慢性压迫性损伤(CCI)模型中，

脊髓背角p-ERK水平显著上调;早期鞘内注射促分

裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)抑制剂U0126，可有效

阻断和延迟CCI诱导的机械性异常性疼痛和热痛觉

过敏。秦晓辉等I研究结果表明,AGM对甲醛所致 大鼠疼痛反应有明显的镇痛作用;并且，在甲醛致痛 前预先给予AGM 160 mg/kg,能明显抑制甲醛所致脊

髓背角磷酸化ERK表达量的上调。以上研究提示, ERK 信 路 在 DNP 中

关 的作用。本实验结果表明,AGM( 150,300 mg/kg)可降

低DNP大鼠脊髓ERK磷酸化水平。这提示AGM对 DNP 鼠的镇痛

与 脊 p-ERK 的活，减少脊髓内伤害性信号传导有关。AGM为中国人民军事医学科学院毒物

药物研究所承担的重大新药创制课题在研项目，目

前尚未在国内上市，故而国内未有相关临床应用报 道。在国外，已有研究表明高剂量硫酸孤丁胺方案 (2.670 g/d)可连续安全食用长达5年，且在整个研

究期间未出现不良反应「⑷。研究表明，在膳食中添

加AGM可用于缓解腰椎间盘相关神经根病的疼 痛,改善生活质量3。综上所述，本研究基于大鼠DNP模型,揭示了42morphine dependence] J]. Addict Biol, 2012,17(2) ：392-408.[4] Li J, Li X, Pei G, et al. Analgesic effect of agmatine and itsen-

hancement on morphine analgesia in mice and rats[J] . Acta Phar­macol Sin, 1999 ,20(1 )：81-85.[]兰忠平，陈雅慧，顾楠，等•脊髓水平给予弧丁胺对鞘内吗啡镇

痛的影响[]•中国应用生理学杂志,2014,30(3) ：197-198.[ 6] Kotagale NR, Shirbhate SH, Shukla P, et al. Agmatine attenuates

neuropathic pain in sciatic nerve ligated rats：Modulation by hipp­ocampal sigma receptors[ J]. Eur J Pharmacol, 2013,714 (1-3 ): 424-431.[ 7 ] Molderings GJ, HaenischB. Agmatine ( decarboxylated L-argi-

nine)： physiological role and therapeutic potential[ J] . Pharmacol

Ther, 2012,133(3)：351-365.[8 ] Li Y, Cheng KC , Asakawa A, et al. Activation of imidazoline-^

receptors ameliorates pancreatic damage [ J] . Clin Exp Pharmacol Physiol, 2015 ,42(9) ：9-971.[ 9] Pan B, Zhong P, Sun D, et al. Extracellular signal-regulated ki­

nase signaling in the ventral tegmental area mediates cocaine-in­

duced synaptic plasticity and rewarding effects [ J] . J Neuro­science, 2011,31(31)：11244-11255.[ 10] Xu X, Chen H, Ling BY, et al. Extracellular signal-regulated pro­

tein kinase activation in spinal cord contributes to pain hypersensi­

tivity in a mouse model of type 2 diabetes [ J] . Neurosci Bull, 2014,30(1)：53-66.[ 11 ] White JP, Cibelli M, Fidalgo AR, et al. Extracellular signal-regu­

lated kinases in pain of peripheral origin [ J] . Eur J Pharmacol,

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tivation in the spinal cord can block initiation of peripheral nerve injury-induced neuropathic pain in rats [ J ]. Acta Physiologica Sin- ica, 2011 畐3(2) ：106-114.[13]秦晓辉，吴宁，苏瑞斌,等•弧丁胺抑制炎性疼痛诱导脊髓磷酸

化细胞外信号调节激酶表达上调[J].中国临床药理学与治疗

学,2007,12(9) ：1018-1022.[ 14] Gilad GM, Gilad VH. Long-term ( 5 years), high daily dosage of

dietary agmatine--evidence of safety：a case report [ J] . J Med Food, 2014,17(11) 1256-1259.[15 ] Keynan 0, Mirovsky Y, Dekel S, et al. Safety and efficacy of diet­

ary agmatine sulfate in lumbar disc-associated radiculopathy. an

open-label，dose-escalating study followed by a randomized，doub- le-blind，placebo-controlled trial [ J] . Pain Med，2010 ，11 ( 3 )： 356-368.

(收稿日期：2018-10-24)